大学生物化学试验复习

1. 维生素C含量测定 2. 小麦种子蛋白质含量测定 3. 小麦种子淀粉酶活性测定 4. 层析法测蛋白质末端氨基酸 5. 质粒抽提和基因组抽提

6. 琼脂糖凝胶电泳测质粒DNA纯度 7. PCR体外扩增DNA 8. 亲和层析纯化目的蛋白 9. 凝胶过滤层析分离蛋白质

10.PAGE电泳检测目的蛋白分子量、表达量

1

维生素C含量测定～2，6-二氯酚靛酚

1. 原理

VC具有还原性（烯醇式结构）

2,6-二氯酚靛酚具有氧化性（羰基），酸红碱蓝。

当用2,6—DICP滴定含有抗坏血酸的酸性溶液（草酸溶液）时，在抗坏血酸未被全部氧化前，滴下的2,6—DCIP 立即被还原成无色，一旦溶液中的抗坏血酸全部被氧化时，则滴下微量过剩的2,6—DCIP 便立即使溶液显示淡粉红色或微红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。

2. 步骤

2.1空白对照

取10ml 1%的草酸溶液于锥形瓶中用2，6—二氯酚靛酚溶液滴定至淡粉红色出现，并保持15s不褪色，记下所消耗的染料的微量移液器

体积A

(胡克定律)

标准维生素C的滴定：

0.5～10μl 取10ml维C标准液（0.01mg/ml）于锥形瓶中，用2，6—

二氯酚靛酚溶液滴定至淡粉红色出现，并保持15s不褪色，即滴

20～200μl 定终点所用染料的体积B

100～1000μl B-A即相当于0.1mg维C，由此可求出

T:每ml 2，6—二氯酚靛酚溶液相当于维C的质量(mg)

1000 ～5000 μl

2.2 称取新鲜蔬菜或水果-研磨-过滤-定容

2.3 滴定：用2，6—二氯酚靛酚溶液滴定，直至溶液呈

浅粉红色15s不褪色为止，记录所用染料的体积C

2

2.4 计算

T为1ml染料相当于维生素C的量（mg) C为滴定样品所耗用的染料体积(ml) A为空白对照所耗用的染料体积(ml)

每100g样品含有维生素C含量mg数=T(C-A)N/W×100g

小麦种子萌发前后蛋白质含量测定～双缩脲反应➕福林酚

1.原理

 比色法：通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法

1.1 双缩脲反应：蛋白质加碱性铜 1.2 加入福林酚试剂—>蓝色混合物

1.3 用分光光度计测OD值（与浓度成正比） 1.4 制作标准曲线y=kx+b

1. 选择标准蛋白溶液(牛血清白蛋白），配制一定浓度母液

3

2. 配制标准溶液浓度梯度，测定对应的OD值 3. 根据浓度和OD值得回归方程即标准曲线

2.步骤

2.1 制备目的溶液定容（NaCl溶液）离心取上清

休眠/萌发种子＋NaCl溶液＋石英砂—>匀浆

2.2 混匀试剂测定

2.3 作曲线（牛血清蛋白）

浓度作为横坐标，OD值作为纵坐标，做标准曲线，写出回归方程2

以及R值

小麦种子淀粉酶活性测定～水杨酸与还原糖反应

1.原理

1.1 酶活力

酶催化一定化学反应的能力，通常用一定条件下酶所催化的某一化学反应的反应初速度。

1. 国际单位（U）：在特定条件（25℃，其它为最适条件） ，

每分钟内催化1μmol底物转化成为产物所需要的酶量为1个活力单位，即1U = 1μmol/min。

2. 自定义单位

定义在40℃、pH 5.6的条件下，1 min内水解淀粉生成1 mg麦芽糖所需要的酶量为1U

4

酶促反应速度 单位时间内底物的减少量或产物的生成量

1.2 还原糖与3，5-二硝基水杨酸（DNS）

2.步骤

2.1 制备目的溶液

休眠/萌发种子研磨定容（柠檬酸）离心取上清

2.2 混匀试剂测定（对照组失活）

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2.3 作标准曲线（麦芽糖）

薄膜层析——测蛋白质末端氨基酸～DNS-Cl法

1.原理

1.1 层析：利用理化性质不同，将多组分分离纯化。

1.2 DNS丹磺酰氯法

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1.3 Edman-DNS法

1.4 DNS-Cl＋蛋白质DNS-蛋白质

酸水解：DNS-蛋白质DNS-N端氨基酸

1.5 酸性条件抽提、层析

用乙酸乙酯抽提DNS-N端氨基酸做层析分析，强烈的黄色荧光 同时制备DNS-标准氨基酸做对照，利用层析进行N末端氨基酸的鉴定。

1.6 聚酰胺薄膜

大量酰胺基团的高分子化合物，与某些基团形成氢键，而产生吸附作用，氢键的强弱决定了吸附力的大小

1.7 展层剂

与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键

nHOOC(CH2)COOH +4(nH2N(CH2)6NH2CONH(CH2)6NHCO)nNHC(CH2)4O

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2.步骤

2.1 DNS-标准氨基酸的制备（Phe Gly Val）

2.2 DNS-氨基酸层析

1) 在聚酰胺薄膜距边线1cm处，用铅笔标记4个点 2) 毛细管点样1次，直径不超过2mm

3) 放入展层剂中展层，距上边缘0.5cm时取出，电吹风吹干。

展层剂前沿

2.3 待测蛋白质N-末端氨基酸鉴定：比较（365nm) Rf = a/l

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质粒抽提和基因组抽提～碱变性法

1.原理

酶切

载体分子

连接 DNA重组分子

酶切

外源基因

受体细胞(感受态）

鉴定与表达 转化 扩增

重组转化子

重组产物分离纯化 工程菌或细胞培养

1.1 基因工程流程 1.2 质粒Plasmid

1. 于染色体外自我复制的DNA分子（存在于某些细菌、真

菌、植物线粒体等）

2. 双链、闭环、超螺旋(少数线性） 3. 使宿主具有一些额外的特性比如氨苄青霉素抗性基因。 4. 质粒具有自主复制能力（依赖于宿主细胞）（紧密型、松弛型）

1.3 质粒载体的特点

1. 分子量小，能容纳较大外源DNA片段插入 2. 有选择性标记基因，易被识别筛选 3. 含多克隆位点

4. 自我复制，多拷贝、松弛控制型，易纯化

9

10

1.4 碱变性法（先变性后复性）提取纯化质粒DNA

2.步骤

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琼脂糖凝胶电泳～测定质粒DNA浓度纯度

1.原理

1.1 电泳：带电物质在电场中向所带电荷相反方向移动的现象

鉴定原理：电荷性质、电荷数量、分子量泳动方向、速度不同 外界因素：电场强度、筛孔、缓冲液pH

（阻碍Ph变化的溶液：醋酸+醋酸钠，氨水＋氯化铵）

1.2 DNA分子泳动速度与形状有关

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

一条链断开的开环DNA（ocDNA）,开环DNA泳动最慢；  两条都断开的线状DNA（LDNA），线性结构泳动速度居中。  共价闭合环状DNA（cccDNA）,超螺旋结构泳动最快

1.3 琼脂糖 Agarose（多聚半乳糖）

线性多聚物、35-40°形成半固体凝胶、亲水性、惰性载体、 孔径可调（浓度越大，孔径越小）

1.4 DNA染料

1. 琼脂糖中的染料和DNA结合荧光增强几十倍 2. 荧光强度∝DNA含量 （与已知标准样品对照）

1.5 DNA Marker

已知分子量的不同DNA片段混合溶液估算DNA分子量大小、浓度

1.6 DNA电泳溶剂



TAE缓冲液（维持Ph、导电性）

Tris碱 乙酸 EDTA (螯合Mg2+,防止激活DNA酶)



6×Loading buffer（电泳程度指示剂、加大样品密度）

EDTA 甘油 二甲苯腈蓝 溴酚蓝

1.7 酶标仪测定质粒浓度和纯度



核酸具有吸收紫外光线的能力，在波长为260nm的条件下具吸收峰值，而蛋白质在280nm时具有吸收峰值。  纯核酸溶液OD 260=1.8～2.0时，认为已达到所要求的纯度。 ＞ 2.0 RNA污染 ＜ 1.8 pr污染

2.步骤

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2.1 制胶

2.2 加样: 质粒＋10×Loading buffer

2.3 电泳：100V泳动2/3

点样孔接负极（DNA含大量磷酸基团） 2.4 紫外灯观察（260nm最大吸收波长）

PCR – DNA体外复制扩增

1.原理

1.1 DNA体内外复制

冈崎片段是相对较短的DNA核苷酸序列，它们的合成是不连续的，并随后通过DNA连接酶连接在一起，形成DNA复制过程中的滞后链。

相同点：以DNA链为模板，在引物作用下，四种脱氧核糖核苷酸为原料，按照5’3’的原则在DNA聚合酶的作用下合成DNA链

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1.2 多聚酶链式反应

94℃高温变性 解开DNA双链

℃低温退火 结合引物

72℃中温延伸 复制互补DNA

1.3 PCR反应体系成分

1. DNA模板 2. DNA聚合酶

3. Tris-Cl反应缓冲液（pH约为8） 4. dNTP Mix(dATP、dGTP、dTTP、dCTP) 5. Mg2+/Zn2+ (Taq聚合酶成分之一) 6. 两条合成的DNA引物(特异性)

1.4 引物要求

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1.5 引物设计的目的：获得目的基因片段/鉴定

1.6 保护性碱基

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被性核酸内切酶识

别 切开,因此在设计 PCR 引物时,人为的在酶切位点序列的 5’端外侧添加额外的碱基序列, 即保护性碱基

1.7 荧光检测方法：Tapman探针法、SYBR Green染料法 1.8 PCR技术发展

1.9 以获得目的片段为目的的引物设计

2.步骤

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2.1 2.2

扩增YFP基因（黄色荧光蛋白）、斑马鱼PSME3 PCR产物检测——琼脂糖电泳

2.3

对照Marker估计产物长度

亲和层析～利用His-tag纯化目的蛋白

1.原理

1.1 五大层析

    

凝胶过滤层析 — 大小

离子交换层析 — 电荷 疏水层析 — 疏水性

亲和层析 — 生物识别（配基） 反向层析

1.2 亲和层析



固定相：基质（载体）连接配基

配基：与目的蛋白特异结合的物质叫蛋白质的配基

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

流动相:不同浓度洗脱液

亲和层析过程



配基固相化 — 配基+载体



亲和吸附 — 通过混合物，其中目的蛋白+配基+载体 

解吸附 — 通过缓冲液，洗脱目的蛋白

融合蛋白

通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物

标签蛋白

利用DNA体外重组技术，把目的蛋白融合表达一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白的表达检测、示踪和纯化等。 常见标签：His6,Tag

1. 由于只有6个氨基酸，分子量很小，对蛋白结构和活性的影响较小，一般不需要酶切去除；

2. 可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能

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1.31.41.51.6 镍柱纯化His-tag融合蛋白的原理

1. 组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱（镍琼脂糖凝胶）结合 2. 用咪唑竞争洗脱。

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1. 接种-诱导表达

2. 裂解蛋白质

收集菌体，离心，取沉淀，加入裂解缓冲液，4℃超声破碎，离心20min，蛋白质即在上清液。

（上清取50ul备用，作为纯化前的对照）

3. 装柱

关闭柱子开关（先确定旋钮上下哪是开），吸取凝胶 3ml，缓缓灌入柱子中。

4. 冲洗柱子（ddH2O）

5. 平衡

咪唑溶液沿壁旋转缓缓加入柱子中，打开开关，释放缓冲液，用烧杯接废液 目的：使凝胶处于一定盐浓度和pH

6. 上样 将细胞裂解液上清5ml缓缓加入柱子中，将开关打开，让未结合的蛋白随液体缓缓流出，收集流穿液。

7. 洗涤和洗脱

0/20/200Mm/1M咪唑缓冲液 →离心管收集

8. 柱子清洗

20ml蒸馏水用力冲洗凝胶，最后将凝胶保存在蒸馏水中。

9. 样品保存

各个浓度的洗脱液各取100ul（做好标记）在紫外下观察荧光程度

10. 浓缩 将溶液加入浓缩管后，8000rpm，5min，吹打溶液吸出上交保留PAGE电泳

2.步骤

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凝胶过滤层析——分离（不同分子大小）蛋白质

1.原理

超过滤

1.1 柱效分析

理论塔板数

不对称因子

1.2 蛋白质纯化相关理化性质



分子大小

超过滤、透析、凝胶过滤、超速离心、

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

带电特性 溶解度

盐析：高浓度盐离子与蛋白质争夺水，影响电荷，不变性 等电点沉淀：蛋白质净电荷为0，不相互排斥，碰撞产生沉淀 有机溶剂分级沉淀：降低水的介电常数，蛋白质表面脱水，聚集





配体结合 吸附性 变性和复性





2.步骤

2.1 装柱

固定+双蒸水排空气，关闭出口

轻轻搅拌凝胶浆液，玻璃棒引流打开出口，凝胶均匀沉降 反复加入凝胶浆液（搅动胶面混合均匀）保证双蒸水盖过胶面 装柱至2/3处

2.2 平衡

双蒸水-恒流泵-上管口（保留0.5cm水面）-下管口-紫外检测仪 （A280=0）

2.3 加样 （时刻保留水层）

打开柱盖 丙酮（沿壁旋转缓慢加入）双蒸水冲洗 加蒸馏水盖盖

2.4 洗脱收集

打开恒流泵开关，监视紫外检测仪开始出峰，立即收集

丙酮全部流出，紫外检测仪变为0蒸馏水冲洗

记录实验结果，拍照分析，计算As值，分析不对称原因

3.分离蓝色葡聚糖和VB12

3.1 平衡

用缓冲液Tris-Cl Ph8.0 平衡3个柱体积- A280手动调0-调恒流泵

3.2 上样

打开盖子沿壁缓慢加入混合样品蒸馏水冲洗缓冲液加满、盖盖

3.3 收集

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打开恒流泵、关注出峰情况、（出峰时）收集流出液

3.4 记录

SDS-PAGE电泳～检测目的蛋白分子量、表达量

1.原理

1.1 聚丙烯酰胺电泳

丙烯酰胺聚合交联成三维网状结构，以此凝胶为支持物的电泳

1.2 凝胶成分

1. 30%丙烯酰胺溶液：Acr:Bis=29:1 2. 过硫酸铵APS:提供自由基

3. 四甲基乙二胺TEMED：催化APS

1.3 凝胶特性

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1.4 Loading buffer

 

 

巯基乙醇DTT：强还原剂，打开蛋白质二硫键

SDS：十二烷基硫酸钠，使蛋白质变性形成蛋白质-SDS复合物

复合物带相同密度负电荷，无电荷差别，取决于分子量 甘油：增加比重 溴酚蓝：指示剂

1.5 浓缩胶5%-分离胶12%

凝胶孔径





浓缩胶的凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间而被浓缩至一个狭窄的区带，大大提高了电泳的灵敏度。

缓冲体系离子成分、pH

pH6.8 尾随离子CH2(NH2)COO－|蛋白质|前导离子Cl－

Ph8.8 甘氨酸街力度增加，迁移率超过蛋白质，无高电压

1.6 考马斯亮蓝

1. （G250）与蛋白质结合呈蓝色的染料最大吸收峰∝蛋白质含量 2. (250)对电泳条带染色

2.步骤

2.1 制备分离胶、浓缩胶

不同浓度丙烯酰胺溶液+不同pH的SDS+TEMED+APS

2.2 加样

样品+Loading buffer加热、离心取上清 Marker对照

2.3 电泳

样品端接负极（短玻璃端）－电泳溴酚蓝距离分离胶底端1cm

2.4 染色

电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝R250染色液，染色30min；

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2.5 脱色

染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，每隔10min更换一次脱色液，直至条带清晰。

基因工程～CRISPER/cas9基因编辑

1. 构建重组质粒的流程（GFP插入pET-28a）

1、查找GFP的基因序列

2、分析质粒选择合适的酶切位点(质粒有而目的基因没有)

3、设计引物（NCBI）并加入酶切位点（为了获得目的基因）和保护性碱基（识别） 4、扩增GFP基因片段

5、利用合适的性内切酶酶切载体和PCR片段并利用连接酶连接 6、将重组质粒转化宿主菌株挑选阳性克隆，扩大培养

7、抽提质粒，测序，与目的基因进行比对，看是否插入成功以及是否发生了突变

2. 鉴定斑马鱼PSME3基因是否编辑成功

   

查找PSME3基因序列（查找mRNA序列）

设计PCR引物，扩增产物必须包含编辑的片段

提取斑马鱼基因组做PCR扩增并对产物进行测序，得到编辑后的序列 编辑后序列与编辑前PSME3序列进行序列比对分析

3. CRISPER/cas9基因编辑

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