维普资讯 http://www.cqvip.com ・５６６・ 东医学２００８年４月第２９卷第４期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｐｒ．２００８，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．４ ＰＣＲ扩增法 检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的 ｍｅｃＡ基因水 王敏 范婧 李先平 中南大学湘雅二医院检验科（长沙４１００１１）； 中南大学湘雅医学院医学检验系２００２级（长沙４１００１３） 【摘要】 目的应用ｍｅｃＡ基因ＰＣＲ扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球茵（ＭＲＳＡ）。方法对临床分离 的８４株金黄色葡萄球茵，应用ｍｅｃＡ基因ＰＣＲ扩增法鉴定ＭＲＳＡ，并与苯唑西林纸片扩散法和头孢西丁纸片扩散 法进行比较。结果８４株金黄色葡萄球茵中，４１株金黄色葡萄球茵的ｍｅｃＡ基因扩增呈阳性，其中有１株表现为 对苯唑西林敏感；苯唑西林纸片扩散法检出４２株阳性，其中有２株ｍｅｃＡ基因呈阴性。头孢西丁纸片扩散法与 ＰＣＲ扩增法的试验结果完全符合。结论ｍｅｃＡ基因ＰＣＲ扩增法可以准确、快速判定ＭＲＳＡ。 【关键词】ｍｅｃＡ基因 耐甲氧西林金黄色葡萄球茵ＰＣＲ 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是医院感染的重要病 葡萄糖产酸。②耐甲氧西林金葡菌的鉴定（药敏纸片 原菌，对常用的包括甲氧西林在内的多种抗生素广泛 扩散法）：将临床分离得到的金黄色葡萄球菌用无菌生 耐药。其主要耐药机制是ｍｅｃＡ基因编码低亲和力的 理盐水配制成约为０．５麦氏浊度的悬液，无菌棉签蘸 青霉素结合蛋白２ａ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ ２ａ， 取菌液均匀涂布于ＭＨ琼脂表面，然后将含３０ ｇ／片 ＰＢＰ２ａ）所致。本研究利用ＰＣＲ技术对金黄色葡萄球 头孢西丁和１ ｇ／片苯唑西林的药敏纸片贴于其上， 菌的ｍｅｃＡ基因进行检测来鉴定ＭＲＳＡ，并与药敏纸片 ３７℃恒温孵育２４ ｈ后测量抑菌环直径。结果判定标 扩散法进行比较，结果报告如下。 准：头孢西丁抑菌环直径≤１９ ｍｍ为耐药，＞１２０ ｍｍ为 １材料与方法 敏感；苯唑西林抑菌环直径≤１０ ｍｍ为耐药，１１— １．１标本来源８４株金黄色葡萄球菌来自２００６年９ １２ ｍｍ为中介，≥１３ ｍｍ为敏感…。 月至２００７年５月间本院患者的血、尿、痰、创面分离 １．４．３ ＰＣＲ扩增法 ①模板ＤＮＡ制备：将经Ｍｉ— 物、引流液等标本。 ｃｒｏｓｃａｎ Ｗ／Ａ ９６全自动微生物鉴定系统鉴定的金黄色 １．２主要仪器和试剂 Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ Ｗ／Ａ ９６全自动微 葡萄球菌转种于血平皿，于３７℃孵育１６—１８ ｈ。挑取 生物鉴定及药敏系统为美国都灵公司产品；细菌基因 ３—４个菌落置于４００ Ｉｘｌ的裂解液（１０ ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ— 组ＤＮＡ提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司； ＨＣ１、１．０ ｍｍｏｌｆＬＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ），再加入２ ｌ的 ＰＣＲ试剂为ＴａＫａＲａ公司产品；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｄ购自北京 １０ ｍｒ，／ｍｌ的蛋白酶Ｋ及４００ ｍｒ，／ｍｌ葡萄球菌溶菌酶 天根生化科技有限公司；ＭｅｃＡ基因扩增引物由上海英 １０ ｌ，混匀，置３７℃水浴３０ ｍｉｎ，其余步骤接北京天根 骏生物技术有限公司合成，引物１：５ 一ＧＴＡＧＡＡＡＴ－ 生化科技有限公司的细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒说 ＧＡＣＴＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＴＡＡ一３ （２６８—２９２ ｂｐ）２：５ 一 明书的第４步进行操作。②ＰＣＲ扩增：扩增反应总体 ＣＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＴＴＧＴＩＴＣＧＧＴＣＴＡＡ一３ ｆ ５７７—５５３ 积为２５ ｌ，其中１０×Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ“ｐｌｕｓ）２．５ Ｉｘｌ、 ｂｐ）；ＰＣＲ扩增仪为德国Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司产品；凝胶成像 ｄＮＴＰ（１０ ｍｍｏｌｆＬ）２ Ｉｘｌ、引物１（２０ ｖ，ｍｏｌ／Ｌ），引物２ 仪为美国伯乐公司产品；药敏纸片：１ ｇ／片苯唑西林， （２０ ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ）各０．５ 、模板ＤＮＡ（２ ｍｍｏｌｆＬ）２ 、 ３０ ｇ／片万古霉素，购自英国ＯＸＩＯＤ公司。 Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（５ Ｕ／ｐＡ）０．５ ｌ、ｄｄＨ２０１７ ，离心混 １．３ 质控菌株 金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２５９２３， 匀后置ＰＣＲ仪上进行自动化扩增反应，循环参数为 ＡＴＣＣ２９２１３。 ９４℃２ ｍｉｎ。９４℃３０ Ｓ，５０℃３０ Ｓ，７２℃４５ Ｓ，共３０个循 １．４ 方法 环，最后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。 １．４．１ 标本采集及培养标本按常规方法采集接种 １．５统计学方法采用 检验。 于相应培养基，３７ｃＩ＝孵育培养１８—２４ ｈ。 ２结果 １．４．２ 细菌鉴定和药敏 细菌鉴定采用Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ ２．１纸片扩散法检测８４株金黄色葡萄球菌，４２株 Ｗ／Ａ ９６全自动微生物鉴定仪和手工法，①金黄色葡萄 对苯唑西林敏感，４２株对苯唑西林耐药；４３株对头孢 球菌的鉴定：血浆凝固酶阳性，触酶试验阳性，Ｇ 球菌 西丁敏感，４１株对头孢西丁耐药。 且呈葡萄状排列，还原硝酸盐，ＶＰ试验阳性，厌氧分解 ２．２ ＰＣＲ扩增法检测８４株金黄色葡萄球菌，ｍｅｃＡ 基因阳性共４１株。ＰＣＲ扩增法和纸片扩散法的对比 ｝湖南省自然科学基金（编号：０６ＪＪ４０５１） 见表１。三种方法检测结果差异无显著性。 维普资讯 http://www.cqvip.com 广东医学２００８年４月第２９卷第４期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｐｒ．２００８，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．４ 表１ ３种方法检测ＭＲＳＡ的结果 株 ．５６７． 葡萄球菌可产生一种青霉素结合蛋白ＰＢＰ２ａ。这种蛋 白存在于细胞表面，对ｐ一内酰胺类抗生素有极低的 亲合力，其相对分子质量（Ｍｒ）为７８ ０００ 。由于 ＰＢＰ２ａ具有对Ｂ一内酰胺类的低亲和性，因而在ｐ一内 酰胺类存在的情况下，当其他的ＰＢＰ均被抑制，不能发 挥正常生理功能时，ＰＢＰ２ａ则不被抑制，能够代替其 ）ｃ ＝０．０３，Ｐ＞０．０５ ２．３扩增产物分析 他被抑制的ＰＢＰ发挥作用，使细菌细胞得以生存而产 生耐受性 。决定ＭＲＳＡ细胞产生ＰＢＰ２ａ的是一系列 取５ 扩增产物与ｌ 上 ２．３．１ 琼脂糖凝胶电泳法具有编码ＰＢＰ２ａ调节表达功能的ｍｅｃ基因（ｍｅｃＡ， 样缓冲液（６ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）混匀后点样于含０．５ ｍｌ 溴化乙锭的２％琼脂糖凝胶，１５０ Ｖ电泳２０ ｍｉｎ后，在凝 胶成像仪中观察结果并照相，见图ｌ。可见ｍｅｃＡ基因扩 增后出现一条３１０ ｂｐ大小的ＤＮＡ片段。 Ｍ：标准分子量ＤＮＡ；１：金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ ２５９２３；２：金黄色 葡萄球菌ＡＴＣＣ ２９２１３；３～１０：为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 图１ ｍｅｃＡ基因扩增产物电泳图 ２．３．２ ＰＣＲ扩增产物测序 以ＭＲＳＡ的ＰＣＲ扩增产 物为模板，以ＰＣＲ扩增的引物为引物，委托上海博亚 生物技术有限公司进行序列测定，将测序结果（２６２ｂｐ） 与ＮＣＢＩ网站上ｍｅｃＡ基因作Ｂｌａｓｔ分析，发现它们核 苷酸同源性为９９．２３％，Ｓｃｏｒｅ值高达４９６，分析结果见 图２。说明所检测的基因为ｍｅｃＡ基因。 ＱｕｅｒＹ １ ＴＴＴｃ＾＾ＴＡＴＧＴＡＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＴＣＴＧＣＡＴＴ（２８ＴＧＧＡＡＴ从ＴＧＡＣＧＣＴＡＴＧＡＴＣＣＣ从Ｔ ６０ ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌＩｌｌｌ…ｌｌｌＪｌｌｌｌｌｌｌｌＩｌｆｌＩｌｌｌｌｌｌｌｌｌＩｌｌｌＩｌｌｌｌｌｌｌｌｌＩ Ｓｂｊｃｔ ５２６ ＴＴＴＣ＾ＡＴＡＴＧＴ＾ＴＧｃＴＴＴＧＧＴＣＴＴＴＣＴＧｃ＾ＴＴｃｃＴＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＣＴＡＴＧＡＴＣＣＣＡＡＴ ４６７ Ｑｕｅ ｒｙ ６１ ＣＴＡＡＣＴＴＣＣＡＣＡＴＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＣＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＴＴＡＣ １２０ ＩｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌＩｌｌｌｌＪｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌＩｌＩｌｌｌｌｌｌｌｌｌＩｌｌｌｌｌｌｌｌｌ Ｓｂｊｃｔ ４６６ ＣＴＡＡＣＴＴＣＣＡＣＡＴＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＣＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＴＴＡＣ ４０７ ＱｕｅｒＹ １２１ ＣＧＴＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴ从ＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＡＣＴｃＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＡＣＴＴＴＴＴ １８０ ｌｌｆｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌＩｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌＩｌｌｌＩｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ Ｓｂｊｅｔ ４０６ ＣＧＴ＾ＧＴＴＴＧＴＴＴＴ从ＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧ＾ＧＣＡＴＣＴ＾ＣＴＣＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴ＾ＧＡＴ＾ＣＴＴＴＴＴ ３４７ ＱｕｅｒＹ １ ８１ ＴＴＡＴＴＴＴＡＣＧＡＴＣＣＴＱ从ＴＧＴＴＴＡＴＡＴＣＴＴＴ从ｃＧＣＣＴＡ从ＣＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＣＧ ２４０ ｌｌｌｌｌＩｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌＩｌｌｌｌｆｌｌｌＩｌｌｌｌｌｌｌｌＪｌｌｌｌｌｌＩｌｌｌｌＩｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ Ｓｂｊｃｔ ３４６ ＴＴＡＴＴＴＴＡＣＧＡＴＣＣＴＧ从ＴＧＴＴＴＡＴＡＴＣＴＴＴ从ＣＧＣＣＴＡ从ＣＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＣＧ ２８７ Ｑｕｅｒｙ ２４１ ＧＡＣＧＴＴＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＴ＾２５８ ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌＩｌｌｌｌｌ Ｓｂｊｃｔ ２８６ ＧＡＣＧＴＴＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＴＡ ２６９ 图２ ｍｅｃＡ基因的Ｂｌａｓｔ分析结果 ３讨论 自１９６１年初首次发现ＭＲＳＡ以来，ＭＲＳＡ的感染 正以惊人的速度在世界范围蔓延和流行。因此，临床 上将ＭＲＳＡ作为三大感染源之一 ｌ 。ＭＲＳＡ菌株对甲 氧西林耐药机制有两种形式：由耐药基因介导的固有 耐药和质粒介导产生大量Ｂ一内酰胺酶繁荣获得性耐 药。目前研究表明，ＭＲＳＡ产生的主要原因是金黄色 ｍｅｃＩ，ｍｅｃＲＩ），ＭｅｃＩ和ｍｅｃＲＩ是位于ｍｅｃＡ启动子上 游的转录调节基因，ｍｅｃＩ基因编码抑制蛋白ｍｅｃＩ， ｍｅｃＲＩ编码细菌产生ＰＢＰ２ａ所必需的诱导蛋白ｍｅｃＲＩ。 ｍｅｃＡ基因是导致金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药的 主要原因。有些国家如瑞典、丹麦、荷兰等已将ｍｅｃＡ 基因的测定作为ＭＲＳＡ的确认试验，根据ｍｅｃＡ基因 的有无而非体外药敏结果来测定是否耐药菌，将含有 ｍｅｃＡ基因的菌株特称为ＭＲＳＡ，将ｍｅｃＡ基因阴性但 药敏结果耐药的菌株称为对甲氧西林耐药的金黄色葡 萄球菌。检测金黄色葡萄球菌中的ｍｅｃＡ基因，可作 为ＭＲＳＡ感染观测的一项分子标志 。 本实验ＰＣＲ方法对ｍｅｃＡ耐药基因的测定结果显 示，在８４株金黄色葡萄球菌中，４ｌ株金黄色葡萄球 菌的ｍｅｃＡ基因扩增呈阳性，阳性率为４８．８％；此次实 验同时做了纸片药敏试验，苯唑西林纸片扩散法检出 ４２株阳性，阳性率为５０．０％，在ｍｅｃＡ基因阳性的４ｌ 株中，有１株表现为对苯唑西林敏感。表明这些携带 ｍｅｃＡ基因的金黄色葡萄球菌药敏表现为敏感可能是 因为在ｍｅｃＩ的作用特别强大而诱导剂作用较弱时， ｍｅｃＡ基因处于抑制状态，表达ＰＢＰ２ａ的量很少 。这 类隐匿型或低水平耐药菌株接触Ｂ一内酰胺类抗生素 诱导剂后，ｍｅｃＲＩ诱导蛋白与ｐ一内酰胺类抗生素结合 从而被活化，活化的ｍｅｃＲＩ蛋白可直接或间接破坏 ｍｅｃＩ与ｍｅｃＡ的结合，解除ｍｅｃＩ蛋白对ｍｅｃＡ基因的 抑制作用，使ｍｅｃＡ活化，菌株迅速激活产生ＰＢＰ２ａ，从 而对苯唑西林耐药，其治疗中应避免使用Ｂ一内酰胺 类抗生素。在药敏法阳性的４２株中，有２株ｍｅｃＡ基 因呈阴性，这可能与这些菌株能高度表达Ｂ一内酰胺 酶或存在ＰＢＰ２ａ之外的低亲和力ＰＢＰｓ有关，这些菌株 也应视为ＭＲＳＡ，不同的是其对部分Ｂ一内酰胺类抗生 素或与ｐ一内酰胺酶抑制剂的联合用药可能仍然敏 感。头孢西丁纸片扩散与ＰＣＲ扩增法比较，ｍｅｃＡ阳 性和阴性的菌株与药敏试验结果完全符合。ｍｅｃＡ基 因ＰＣＲ扩增法与纸片扩散法的符合率与谢闺娥等 报道的结果接近。 总之，ｍｅｃＡ基因ＰＣＲ扩增法与纸片扩散法相比， 是鉴定ＭＲＳＡ菌株的快速、简易、稳定成熟的实验手 段，而且敏感性高、特异性强。快速鉴定金黄色葡萄球 菌临床分离株中携带的ｍｅｃＡ基因，对及时使用糖肽 维普资讯 http://www.cqvip.com
．５６８． 医学２００８年４月第２９卷第４期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｐｒ．２００８，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．４ 类抗生素，迅速控制ＭＲＳＡ引起的感染，限制其播散， ｃｉｌｌｉｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ［Ｊ］．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ 以及杜绝糖肽类抗生素的滥用，以减少ＭＲＳＡ的出现 Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００１，４５（６）：１ ７３７—１ ７４２． 均具有十分重要的意义。 ＬＯＵＩＥ Ｌ，ＭＡＴＳＵＭＵＲＡ Ｓ Ｏ，ＣＨＯＩ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｓｔａｐｈ． 参考文献 ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃ／ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，３８（６）：２ １７０— ［１］ Ｚｏｎｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂ— ２ １７３． ｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ）ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ ｆｏｒ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ ＰＥＴＩＮＡＫＩ Ｅ，ＡＲＶＡＮＩＴＩ Ａ，ＤＩＭＩＴＲＡＣ０Ｐ０ＵＬ０Ｓ Ｇ，ｅｔ １ａ．Ｄｅ． ［Ｓ］．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆｒ Ｃｌｉｎｉｃｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ．ＭＩＯ０ ｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｃＡ，ｍｅｃＲ１ ａｎｄ ｍｅｃＩ ｇｅｎｅｓ ａｍｏｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ～Ｓ１４，２００４，２４（１）：４２． ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ［２］ ＳＡＫＯＵＬＡＳ Ｇ，ＧＯＬＤ Ｈ Ｓ，ＶＥＮＫＡＴＡＩＬ￣ＭＡＮ Ｌ。ｅｔ ａ１．Ｍｅｔｈｉ— ｒｅａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００１，４７（３）：２９７— ｃｉＨｉｎ—ｒｅｓｉｓｔｎａｔ ｓｔａｐｈｙｌｃｏｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉ— ３ｏ４． ｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｉｆｅｃＡ—ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ 谢闺娥，许霞，杨能．ｍｅｅＡ基因ＰＣＲ扩增法检测耐甲氧西林金黄 ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ｊ ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００１，３９（１１）：３ ９４６—３ ９５１． 色葡萄球菌［Ｊ］．中国微生态学杂志，２ＯＯ５，１７（６）：４４０—４４２． ［３］ＺＨＡＯ Ｗ Ｈ，ＨＵ ｚ Ｑ，ＯＫＵＢＯ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｙｎｅｒｇｙ （收稿日期：２００７—１２—１９编辑：蔡欣） ｂｅｔｗｅｅｎ ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ ａｎｄ ｂｅｔａ—－ｌａｃｔａｍｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｔｈｉ・・ Ｉ＿１Ｊ］ｖ 腺病毒携带ＥＢ病毒ＬＭＰ１反义基因 抑制人鼻咽癌细胞的生长 王晓侠 姚小宝 嵇宪生 朱宏亮 中国人民解放军第四五一医院耳鼻喉科（西安７１００５４）； 西安交通大学第一医院耳鼻喉科（西安７１００６１） 【摘要】 目的研究ＥＢ病毒ＬＭＰ１反义基因对人鼻咽癌ＣＮＥ２细胞恶性表型的逆转作用。方法 用反义 ＬＭＰ１ＤＮＡ的腺病毒载体ＡｄＥａｓｙ—ＧＦＰ—ＡＬＭＰ１转染人鼻咽癌细胞ＣＮＥ２，Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ法检测转染前、后瘤细 胞的ＬＭＰｌ表达；用ＭＴＴ法和细胞生长曲线实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果建立反义ＣＮＥ２细 胞；转染后ＬＭＰ１蛋白表达降低；转染后细胞活力和生长速度均有下降。结论将反义ＬＭＰＩ腺病毒载体导入细 胞能成功抑制ＣＮＥ２细胞的生长，逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。 【关键词】 ＥＢ病毒反义ＬＭＰＩ基因 鼻咽肿瘤基因治疗 鼻咽癌是我国华南地区一种高发的恶性肿瘤，许 １．２ 鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２的基因的感染 取病毒上 多研究证实鼻咽癌的发生发展与ＥＢ病毒密切相关， 清按感染指数（ＭＯＩ）１：１０感染ＣＮＥ２细胞，３ ｄ后荧光 其中ＥＢ病毒潜伏膜蛋白（ＬＭＰ１）基因在鼻咽癌的发 显微镜下观察绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）表达。 生中起重要作用，６５％以上的鼻咽癌组织中存在有 １．３ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＬＭＰ１蛋白的表达… 用ＥＤ— ＬＭＰ１基因，ＬＭＰ１基因是ＥＢ病毒永生化基因中唯一 ＴＡ一胰酶消化细胞，离心收集细胞，用ＰＢＳ洗２次。 能够转化体外培养的人和啮齿类动物细胞使之具有致 用１×ＳＤＳ凝胶加样缓冲液裂解细胞，沸水浴１０ ｍｉｎ 瘤性的基因。因此阻断ＬＭＰ１的表达，就有可能达到 以变性蛋白质，用超声切割３０ ｓ以剪切大分子量 抑制肿瘤细胞的生长、阻止鼻咽癌的发生和发展的目 ＤＮＡ，离心后收集上清进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶电泳。电 的。本研究将反义的ＬＭＰ１载体转人鼻咽癌细胞中， 泳后将胶转移至ＰＶＤＦ膜上，室温下用１：５０的鼠抗人 抑制鼻咽癌细胞的生长，为鼻咽癌的基因治疗提供一 ＬＭＰ１抗体孵育２ ｈ，冲去转移膜上的多余抗体，加人 种新的实验依据。 １：１ ０００的兔抗鼠酶标抗体在室温下孵育１ ｈ，在暗房 １材料与方法 中加人适量的发光试剂，然后显影、定影后观察结果， １．１材料腺病毒ＡｄＥａｓｙ—ＧＦＰ—ＡＬＭＰ１和ＡｄＥａｓｙ 操作按说明书进行。 —ＧＦＰ由本人构建保存于西安交通大学医学院神经科 １．４甲基偶氮唑盐比色分析法（Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ２ｂａｓｅｄｃｏｌｏｒ 学研究中心；ＣＮＥ２细胞、Ｂｊ５１８３菌和ＤＩ－Ｉ５ｏＬ菌由西安 ｉｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙ，ＭＴＩ＂试验） 将对数生长期的ＣＮＥ２、反义 交通大学生物实验中心惠赠；ＤＭＥＭ、胎牛血清（ＧＩＢ— ＣＮＥ２和空载体转染的细胞ＣＮＥ２消化后，按１×１０’／ｍｌ ＣＯＢＲＬ公司）ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ化学发光分析试剂盒（ＮＥＢ 细胞悬液，以每孔１００ 接种于９６孔培养板中，培养 公司）、ＮＣ膜、ＰＶＤＦ膜（德国宝灵曼公司）、鼠抗人 ２４ ｈ后，每孔加人１０ ＭＴＴ溶液（浓度为０．５％，溶于 ＬＭＰ１抗体（丹麦ＤＡＫＯ公司） ＰＢＳ中）。继续培养４ ｈ，然后吸出孔内液体，每孔加
