课题：2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与技术
2.3 分解纤维素的微生物的分离
【学习目标】
1.能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数 2.从土壤中分离出分解纤维素的微生物
【学习重点与难点】利用选择性培养基对微生物进行分离
【使用说明与学法指导】使用说明：课前利用25min带着预习案中问题导学中的问题认真阅读课本P21-30并独立完成基础知识梳理。
预习案
（一）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.研究思路
（1）筛选菌株：①尿素是一种重要的氮肥，但农作物不能直接吸收利用，需要先通过土壤中的某些能合成＿＿＿＿的细菌将尿素分解为＿＿＿＿＿＿＿＿。
②实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于＿＿＿＿＿＿＿＿生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时＿＿＿＿或＿＿＿＿其他微生物生长。
③选择培养基：在微生物学中，将允许＿＿＿＿种类的微生物生长，同时＿＿＿或＿＿＿其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
④配制选择培养基的依据：根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养＿＿＿＿微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养＿＿＿＿＿＿＿＿的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
（2）统计菌落数目：①测定微生物数量的常用方法有＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。后一种方法难以分辨细菌的死活。 ②稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理
当样品的＿＿＿＿＿＿＿＿足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个＿＿＿＿＿＿＿＿。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在＿＿＿＿＿＿＿＿的平板进行计数。 ③利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是＿＿＿＿＿＿＿＿。
④统计的菌落数比活菌的实际数目＿＿＿＿。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是＿＿＿＿菌落。因此，统计结果一般用＿＿＿＿＿＿＿＿来表示。 （3）设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中＿＿＿＿＿＿＿＿＿对实验结果的影响，提高实验结果的＿＿＿＿。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养＿＿＿＿＿＿的培养基作为空白对照。 2. 实验设计 （1）实验流程 土壤取样 菌落计数 涂布平板与培养 （2）实验过程
①土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。应先＿＿＿＿＿＿＿＿3 cm左右，再取样。
②样品的稀释：分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，其目的是保证获得＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿＿的平板。细菌稀释度为＿＿＿＿＿＿＿＿，放线菌稀释度为＿＿＿＿＿＿＿＿，真菌稀释度为＿＿＿＿＿＿＿＿。 ③涂布平板与培养：培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般＿＿＿＿＿℃培养1～2d，放线菌一般在＿＿＿＿℃培养5～7d，霉菌一般在＿＿＿＿℃的温度下培养3～4d。
④菌落计数：在菌落计数时，每隔＿＿＿＿h统计一次菌落数目。选取＿＿＿＿＿＿＿＿时的记
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录作为结果，以防止因＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿而导致遗漏菌落的数目。
⑤菌落的特征包括＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿等方面。 3. 结果分析与评价
（1）对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助＿＿＿＿＿＿＿＿的方法。
（2）在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的＿＿＿＿将尿素分解成了氨 。氨会使培养基的碱性＿＿＿＿，PH＿＿＿＿。因此，我们可以通过检测培养基＿＿＿＿变化来判断该化学反应是否发生。 （3）在以＿＿＿＿为唯一氮源的培养基中加入＿＿＿＿指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变＿＿＿＿，说明该细菌能够＿＿＿＿＿＿＿＿。 （二）分解纤维素的微生物的分离 1. 基础知识
（1）纤维素和纤维素酶
①纤维素的化学组成：＿＿＿＿＿＿＿＿三种元素，是一种＿＿＿＿糖。
②纤维素酶的作用：纤维素酶是一种＿＿＿＿＿＿＿＿，一般认为它至少包括三种组分，即＿＿＿＿酶、＿＿＿＿酶＿＿＿＿＿＿＿＿酶，前两种酶使纤维素分解成＿＿＿＿＿＿，第三种酶将纤维二糖分解成＿＿＿＿＿＿＿＿。 （2）纤维素分解菌的筛选
①筛选方法：＿＿＿＿＿＿＿＿染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。
②筛选原理：刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成＿＿＿＿＿＿，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，当纤维素被＿＿＿＿＿＿分解后，红色复合物无法形成，出现以＿＿＿＿＿＿＿＿为中心的＿＿＿＿＿＿＿，我们可以通过＿＿＿＿＿＿＿＿来筛选纤维素分解菌。
2.实验设计
（1）实验流程：土壤取样→＿＿＿＿＿＿＿＿→梯度稀释→将样品涂布到＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿上→＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。 （2）实验操作
①土壤取样：采集土样时，应选择＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的环境。
②选择培养：a. 选择培养的目的：增加＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
b. 制备选择培养基：纤维素分解菌选择培养基属于＿＿＿＿培养基，原因是＿＿＿＿＿。 c. 培养基选择作用机制是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。 d. 若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
e. 选择培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于＿＿＿＿上，在＿＿＿＿℃下振荡培养1～2d，至培养基变＿＿＿＿。 （3）梯度稀释：依次将培养液进行等比稀释＿＿＿＿＿＿＿＿倍。
（4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上：将稀释度为104～106的菌悬液各取0．1 mL涂布在平板培养基上，30℃倒置培养。每个稀释度下需涂布＿＿＿＿个平板 （5）刚果红染色法分离：
①染色方法：方法一：先＿＿＿＿＿＿＿＿，再加入刚果红进行颜色反应。
方法二：在＿＿＿＿＿时就加入刚果红。
②挑选产生＿＿＿＿＿＿＿＿的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。 3．结果分析与评价
（1）为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行＿＿＿＿＿＿＿＿实验，纤维素酶的发酵方法有＿＿＿＿＿＿＿＿发酵和＿＿＿＿＿＿＿＿发酵。
（2）纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的＿＿＿＿＿含量进行定量测定。
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1.获得纯净培养物的关键是（ ）
A.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌 B.接种纯种细菌 C.适宜条件下培养 D.防止外来杂菌的入侵 2.高温灭菌的原理是（ ）A.每种微生物生长的最适温度是一定的B.微生物对高温环境不适应 C.高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动 D.高温降低了环境中氧的浓度
3.将配制好的培养基进行灭菌应用（ ）A.灼烧灭菌 B.高压蒸汽灭菌 C.干热灭菌D.煮沸灭菌 4.产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（ ） A.一个细菌、液体培养基 B.许多细菌、液体培养基 C.一个细菌、固体培养基 D.许多细菌、固体培养基
5.灭菌的标准是（ ）A.杀死所有的病原微生物 B.杀死所有的微生物 C.杀死所有微生物的细胞、芽孢和孢子 D.是病原菌不生长 6.对不同微生物的培养过程中正确的是（ ）
A.细菌培养时将PH调至酸性 B.培养乳酸杆菌时在培养基中不需要添加维生素 C.霉菌培养时将PH调至中性或微酸性 D.培养厌氧微生物时则需要提供无氧环境条件 7.不同培养基的具体配方不同，但一般都含( )
A．碳源、磷酸盐和维生素 B．氮源和维生素
C．水、碳源、氮源和无机盐 D．碳元素、氧元素、氢元素、氮元素
8．下列常用的无菌操作中错误的是 ( ) A．用酒精擦拭双手 B．用氯气消毒水源 C．实验操作应在酒精灯火焰附近进行 D．玻璃器皿(吸管、培养皿)可用酒精擦拭 9．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是( )
A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌 B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板 D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板
10.夏天，食品易发生腐败，其原因是空气中微生物在食品上大量生长繁殖的结果，而放入冰箱中贮藏的食品，其腐败的速度比在自然环境中慢得多，对其最好的解释是（ ） A．低温下，食品中物质的代谢速度减慢 B．低温下，微生物的代谢速度减慢
C．隔绝空气，微生物和食品代谢速度均减慢 D．缺乏光照，微生物的合成作用速度减慢 11.下列属于菌落特征的是（ ）
①菌落的形状 ②菌落的大小 ③菌落的多少 ④隆起程度 ⑤颜色 ⑥有无荚膜A.①②③④ B.①②④⑤ C.②③④⑥ D.①②③④⑤⑥ 12、尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时
A、葡萄糖在培养基中越多越好 B、尿素分解菌有固氮能力，故培养基中只需无机氮
C、尿素在培养基中越少越好 D、尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为化合态氮 13、突变型面包霉常需要在基本培养基上添加适当的氨基酸才能生长。现在用两种氨基酸依赖型红色面包霉突变株a和b，分别接种到下面的6种培养基上，两种突变株都不能在1、3、5号培养基上生长，a、b可以分别在2、4和2、6号培养基上生长。培养基成分如下表，关于突变株a和b分别对于A-J中氨基酸需求的说法正确的是 （ ）
培养基 添加氨基酸 1 2 3 CFHI 4 DEFI 5 GHIJ 6 EHGJ BCDE BEFG A．两种突变株对氨基酸的需求是相同的 B．两种突变株都需要G氨基酸才能生长
C．两种突变株必须同时供应4种氨基酸才能生长
D．两种突变株都能在由4、5号两种培养基组成的混合培养基中生长DCBCC DCDCB BDD 14．在接种操作的过程中，不正确的是
A．要将接种环灼烧灭菌 B．取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌
C．将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位D．接种后还要将管口灭菌加塞 15．高压蒸气灭菌的原理是（ ）
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A．高压使细菌DNA变性 B．高压使细菌蛋白质凝固变性 C．高温烫死细菌 D．高温使细菌DNA变性
16．将接种了红色细菌的培养皿置于紫外线下几天，结果培养皿中除长了一个白色菌落外，其余菌落都是红色的，据此，实验者应该（ ）
A.暂不作结论 B.断定是紫外线产生了白色菌落的变异 C. 如果不继续用紫外线照射，预期那个白色菌落将转变为红色 D. 断定白色菌落是一种可遗传的变异
17．在实验室里，从土壤里分离出自生固氮菌所需的培养基属于（ ） A．天然培养基 B．鉴别培养基 C．选择培养基 D．液体培养基 18．在土壤中含有自生固氮微生物比较多的是（ ）
A．表层土壤 B．中层土壤 C．底层土壤 D．所有的土层都是一样的 19．关于灭菌和消毒的不正确的理解是 A．消毒和灭菌实质上是相同的
B．灭菌是指杀死环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子 C．接种环用烧灼的方法灭菌
D．常用灭菌方法有加热法、过滤法、红外线法、化学药品法
20.将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱的目的是（ ） A.对比观察培养基有没有被微生物利用 B.对比分析培养基上是否生有杂菌 C.没必要放入未接种的培养基 D.为了下次接种时再使用 21．在培养基的配制过程中，具有如下步骤，其正确顺序为（ ） ①溶化 ②调pH ③加棉塞 ④包扎 ⑤培养基的分装 ⑥称量 A．①②⑥⑤③④ B．⑥①②⑤③④ C．⑥①②⑤④③ D．①②⑤④⑥③ 22．鉴别纤维素分解菌的培养基中碳源为（ ）
A、CMC-Na B、木聚糖 C、纤维素 D、裂解酶 23．刚果红染色时，加入刚果红应在（ ）
（1）制备培养基时（2） 梯度稀释时 （3）倒平板时（4）涂布时 （5） 长出菌落时 A、（1）（3） B、（2）（5） C、（3）（5） D、（4）（5）
24．为以纤维素为唯一碳源筛选出真菌和细菌，试分析此类微生物在生态系统中的作用与下列哪种生物类似？（ ）A． 硝化细菌 B、 蓝藻 C、蚯蚓 D、兔子 25．用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是（ ） A、未接种的选择培养基 B、未接种的牛肉高蛋白胨培养基 C、接种了的牛肉高蛋白胨培养基 D、接种了的选择培养基
26．用稀释涂布平板法来统计样品中尿素分解菌的数目，为了提高实验结果的可信度，往往要设置对照 ，对于对照组的要求不包括哪项（ ）
A、对照组培养基也严格灭菌，且不接触任何生物 B、对照组和实验组培养基放在相同的条件下培养
C、所用培养基成分及PH大小完全与实验组一致
D、培养基的量的大小与实验组必须绝对相同CBA CAABB ACCCD 27.如下表所示为某微生物培养基的配方，请回答：
⑴依物理性质，该培养基属于 培养基。依用途划分，则属于 培养基。 ⑵根据培养基原料，所培养微生物的同化作用的类型是 ，培养的微生物可是 。 ⑶该培养基中的碳源是 。不论何种培养基，在各成分都溶化后分装前，要进行的 是 。 成分 含量 成分 含量 ⑷若用该培养液培养纤维素分解菌，应除去的NaNO3 3 g FeSO4 0.01 g 物质是 ，应加入的物质是 ，K2HPO4 1 g (CH2O) 30 g 为检测纤维素分解菌的存在与否还应加琼脂 15 g H2O 1 000 ml 入 ，将呈 反应。 MgSO4·7H2O 0.5 g 青霉素 0.1万单 ⑸细菌种群进化过程中，其主要作用的变异来位 源是（ ）
A．环境条件 B．基因重组 C．基因突变 D．染色体变异
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27．提示：本题考查培养基的配制及类型，选择培养基的配制。
⑴固体 ；选择 ⑵异养型；酵母菌或霉菌 ⑶(CH2O) 先调整pH ⑷青霉素和（CH2O）；纤 维素粉；刚果红；红色（透明圈）⑸ C （二）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.（1）①脲酶 氨和CO2 ② 目的菌珠 抑制 阻止 ③ 特定 抑制 阻止 ④ 自养 能固氮的微生物 （2）①稀释涂布平板法 显微镜直接计数
②稀释度 细菌 30-300 ③ 恰当的稀释度 ④ 低 一个 菌落数 （3） 非测试因素 可信度 无杂菌污染 2.（1）样品的稀释 （2）① 铲去表层土
② 不同微生物在土壤中含量不同 菌落数在30～300之间、适于计数 104、105、106 103、104、105 102、103、104 ③30～37 25～28 25～28
④ 24 菌落数目稳定 培养时间不足 ⑤ 形状 大小 隆起程度 颜色 3.（1）生物化学
（2）脲酶 增强 升高 pH （3）尿素 酚红 红 分解尿素 （三）分解纤维素的微生物的分离 1. （1）①C、H、O 多
②复合酶 C1 CX 葡萄糖苷 纤维二糖 葡萄糖 （2）① 刚果红
② 红色复合物 纤维素酶 纤维素分解菌 透明圈 是否产生透明圈 2.（1）选择培养 鉴别纤维素分解菌的培养基 挑选产生透明圈的菌落 （2）① 富含纤维素
②a.纤维素分解菌的浓度
b.液体 无凝固剂（或无琼脂）
c.以纤维素粉为唯一碳源，只有纤维素分解菌才能生存 d.将纤维素粉改为葡萄糖 e.摇床 30 混浊
（3）101～107 （4）3
（5）①培养微生物 倒平板 ② 透明圈
③填表比较两种染色法的各自的优缺点：
染色法 优点 缺点
颜色反应基本上是 操作繁琐 方法一 纤维素分解菌的作用 刚果红会使菌落之间发生混杂
操作简便 产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈， 方法二 不存在菌落混杂问题 有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。
3．（1）发酵产纤维素酶 液体 固体 （2） 葡萄糖
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