RP_HPLC法分析人血白蛋白肽谱方法的建立

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·药物研究与分析·RP-HPLC法分析人血白蛋白肽谱方法的建立

王惠欣　周兴军　张计允　李立敏　李梅彦

　　【摘要】　目的　建立人血白蛋白(plasmahumanserumalbumin,pHSA)肽谱分析方法。方法　采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)的方法,分别用胰蛋白酶还原及非还原方法裂解pHSA,用SephasilpetideC18柱,以0.1%(v v)TFA 水、0.08%(v v)TFA 乙腈为流动相,流速0.5ml min梯度洗脱的方法,检测波长214nm,分析PHSA肽谱。结果　pHSA经胰蛋白酶还原或非还原裂解,适当的酶与底物的比例及酶解的时间,都可以得到重现性好的稳定的肽谱。结论　RP-HPLC法具有灵敏度高,重现性好等优点。本法适用于重组PHSA的肽谱分析。

【关键词】　人血白蛋白;反相高效液相色谱;肽谱　　肽谱是指蛋白质被酶解或化学降解后肽段的分离分析[1]。对于每一种蛋白质,其肽谱是特征的、专一的,因此肽谱分析作为基因工程药物质量控制的重要手段,不仅用于检测蛋白质产品一级结构的完整性和准确性,而且可以鉴定基因工程药物与天然蛋白质的一级结构的一致性,还可以考察产品与标准品之间同质性以及不同批次之间产品的同一性。早期,基因工程药物的肽谱分析指定用SDS-PAGE方法,但具有局限性,用溴化氰化学裂解蛋白质的甲硫氨酸位点,生成的肽段较大,由于肽段少,SDS-PAGE可以根据它们的分子量不同而分辨开,但对于小分子的肽,往往无法分辨或在染色脱色过程中丢失SDS-PAGE[1]。而反相高效液相色谱(RP-HPLC)法[2]是根据肽段的长短和疏水性质来分离,可以分离分子量较小的肽段。本文用RP-HPLC法分析人血白蛋白(plasmahumanserumalbumin,PHSA)肽谱,采用N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮(N-Tosyl-L-Phenylalan1ineChloromethylKetone,TPCK)处理的胰蛋白酶[3]裂解pHSA,再用RP-HPLC法分析裂解片段,获得满意结果。1　材料与方法

1.1　仪器和试剂　WatersHPLC系统,包括两台515型泵,996型二极管阵列检测器,Millennium32数据处理软件。

色谱柱:SephasilpeptideC18(4.6mm×250mm),5μm。TPCK-胰蛋白酶,序列级,为Sigma公司产品;三氟乙酸(TFA)为Sigma公司产品;乙腈,色谱纯,为邯郸林峰公司产品。

PHSA为上海莱士血制品有限公司产品。

1.2　胰蛋白酶切方法　非还原酶解法:取浓度为1mg ml的pH-SA样品对1%碳酸氢铵溶液透析过夜,按1∶50(w w)加入TPCK-胰蛋白酶,37℃酶切24h,用稀TFA酸化至pH2.5,10000r min离心5min,收集上清液,4℃备用,进样前离心去除不溶物[4,5]。

还原酶解法:取pHSA样品30μl(100μg),加30μk缓冲液(100mmol L碳酸氢铵溶液,pH8.5,5mmol L二硫苏糖醇),50℃加热15min,冷至室温后,加5μl100mmol L碘代乙酸,室温15min,加60μl水,最后按1∶50(w w)加入TPCK-胰蛋白酶,37℃酶切24h,用稀TFA酸化至pH2.5,10000r min离心5min,收集上

作者单位:050015　石家庄市,华北制药集团新药研发公司通讯作者:周兴军,050015　石家庄市,华北制药集团新药研发公司

图1　pHSA非还原酶解肽谱时间(min)

06

114120123

清液,4℃备用,进样前离心去除不溶物。

1.3　RP-HPLC肽谱分析方法　色谱条件:柱温:25℃,流速0.5ml min,检测波长214nm,进样量50μl,梯度洗脱程序见表1[流动相A为0.1%(v v)TFA 水,B为0.08%(v v)TFA 乙腈]。

表1　梯度洗脱程序

流速(ml min)

0.50.5

0.50.50.5

A100%100%

20%20%100%

B0080%80%0

2　结果

实验用pHSA样品经胰蛋白酶裂解后,经RP-HPLC分析,用非还原酶解方法,得到的pHSA的肽图见图1;用还原酶解方法,得到的pHSA的肽图见图2。用此方法重复5次,结果完全一致,由此可见,RP-HPLC方法分析pHSA肽谱,有很好的重现性。3　讨论

PHSA分子含有585个氨基酸残基的单链多肽,分子量为658,分子中含17个二硫键,不含有糖的组分。分子中含有24个Arg,59个Lys。胰蛋白酶专一裂解Arg和Lys羧基端的肽键。rHAS用胰蛋白酶裂解,理论上有83个裂解位点。但蛋白质复杂的高级结构有时会阻碍蛋白酶结合于作用位点[6],酶解常不完全或在非Arg、Lys残基上切断,因此产生的分离峰数目与理论裂解峰数目有出入。

本方法采用TPCK-胰蛋白酶,抑制了胰凝乳蛋白酶的活性,保证酶的专一性;在还原酶解法中采用碘代乙酸烷化半胱胺酸残基,使其转变成稳定的衍生物,防止半胱胺酸的巯基在分肽过程中自动氧化成各种产物,包括形成无序的二硫键[1],克服

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河北医药2006年8月第28卷第8期　HebeiMedicalJournal,Aug2006,Vol28,No.8

工程蛋白质的肽谱分析。

参考文献

1　夏其昌.蛋白质化学研究技术与进展.第1版.北京:科学出版社,

1997.9-18.

2　夏其昌,屠红昊.蛋白质和多肽分离分析技术的一些新进展.生命的化学,1990,10:34-37.3　沈同,王镜岩.生物化学.上册.第2版.北京:高等教育出版社,2000.119-122.

4　中国生物制品标准化委员会.中国生物制品规程.北京:化学工业出版社,2000.691-692.5　钟英,郑永军.重组人粒细胞集落刺激因子肽谱分析方法初探.药物分析杂志,2000,20:84-86.6　林炳承,邹雄,韩培桢.高效液相色谱在生命科学中的应用.第1版.

济南:山东科学技术出版社,1996.197-201.

(收稿日期:2006-04-12)

图2　pHSA还原酶解肽谱

了还原酶解的肽谱重现性差的问题。所以采用RP-HPLC方法分析pHSA肽谱,具有专一性强、重复性好、灵敏度高等特点,适用于重组PHSA的肽谱分析,以证明重组PHSA与PHSA的一致性。同时应用这两种酶切方法进行肽谱分析,能较全面的了解基因工程蛋白质的一级结构,同时,此方法也适用于其它基因

·短篇报道·摩罗丹治疗浅表性和萎缩性胃炎224例疗效观察

刘仲秋

　　本院自2004年3月至2006年3月用摩罗丹治疗浅表性和萎缩性胃炎,取得了显著疗效,现总结分析如下。1　资料与方法

1.1　一般资料　大部分门诊患者和少部分住院患者224例,采用同种病3∶1随机法,分为治疗组168例,对照组56例。治疗组168例中,男86例,女82例,男女之比1.048∶1;年龄19～76岁,男性平均43.66岁,女性平均43.87岁。门诊患者151例,住院患者17例;病程16d～33年。全部病例分型均依据临床症状、体征、胃镜检查及病理分型。临床症状及病变部位:患者表现为上腹部隐痛或胀痛、消化不良、纳差、饱胀、烧灼感、反酸、恶心,剑突下压痛或叩鼓等。胃炎:胃镜下表现为粘膜充血、糜烂;萎缩性胃炎:粘膜平坦,以白相为主,可见粘膜下血管网(病理检查略)。

1.2　治疗方法　治疗前1周及治疗中停用凡影响本观察的解痉药、H2受体阻滞剂药物。治疗组口服摩罗丹,每次2丸,每日3次,饭后1h服用,治疗12周(1个疗程);对照组服用法莫替丁糖衣片,每次20mg,每日早晚各1次。两组病例均于服药前及服药12周,记录患者症状变化情况,有无不良反应,复查胃镜、血尿常规及肝肾功能。

1.3　疗效标准　(1)治愈:症状消失,胃镜示病变处粘膜光滑;(2)显效:症状明显好转,胃镜示病变愈合,但仍有轻度充血、水肿;(3)有效:症状好转,胃镜示病变较前好转>50%;(4)无效:症状无变化,胃镜示病变处变化很小或无变化。

2

1.4　统计学分析　计数资料采用χ检验,P<0.05为差异有

表1　治疗组与对照组疗效比较

组别治疗组

对照组

治愈

显效

有效　51(30.36)18(32.14)

例(%)无效

＊＊　10(0.06)

10(17.86)

＊　38(22.62)＊　69(41.07)

10(17.86)18(32.14)

＊P

　　注:与对照组比较,<0.05,＊＊P<0.01

慢性胃炎系指不同病因引起的胃粘膜的慢性炎症或萎缩性病变,其实质是胃粘膜上皮遭受反复损害后,由于粘膜的特异的再生能力,以致粘膜发生退变,最终导致不可逆的固有胃腺体的萎缩甚至消失[1-3]。胃炎的诸多症状用一种药较快并同时解除病情也是医患所盼望的。法莫替丁是H2受体阻滞剂,治疗浅表性胃炎、消化性溃疡疗效肯定,用它作为对照有肯定的意义。摩罗丹在中医传统医学理论基础上辨证施治,配方组成合理,周密精确,治疗慢性浅表性胃炎及萎缩性胃炎的治愈和显效率明显优于对照组(P<0.05)。治疗前后查血尿常规及肝肾功能均未见异常变化。摩罗丹的主要成分为百合、茯苓、玄参、乌药、泽泻、麦冬、当归、白术等,有和胃降逆、健脾消胀、通络定痛的功效,可促进胃肠蠕动、对慢性胃溃疡有明显的粘膜修复作用;显著提高慢性胃炎胃液分泌量、胃酸度及胃蛋白酶活性;显著降低慢性胃炎粘膜层炎性细胞浸润密度;能显著提高胃蛋白酶活性,对胃液及胃酸影响甚小,故可认为该药具有选择性改善胃分泌功能作用,增加胃蛋白酶活性、促进消化作用,对于慢性消化系统疾病患者,亦能显著改善消化功能,增强食欲,缓解纳差、痞满等消化功能不良症状,能较好地预防慢性胃炎的复发,长期服用无毒副作用。

参考文献

1　张洪增.慢性萎缩性胃炎的诊治.中国全科医学,2005,8:985-987.

2　韩立顺.中西药并用治疗慢性胃炎疗效观察.河北医药,2001,23:61-62.3　姚洪森,贺南方,,等.慢性胃病药物治疗进展.中国全科医学,2005,8:578-579.

(收稿日期:2006-04-16)

统计学意义。2　与讨论

2组疗效比较见表1。

作者单位:066200　河北省秦皇岛市山海关人民医院