世界中西医结合杂志２０１ １年第６卷第１０期Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１ １．Ｖｏ１．６．Ｎｏ．１０ ・８３７・ ・实验研究・ 菟丝子黄酮对流产大鼠模型母胎 免疫平衡因子的影响 刘华 韦炳华 马红霞 赖毛华 宋兴华 尤昭玲 陈玉莲 谢军。 丁涛 郑艳华 【摘要】 目的观察中药菟丝子助孕安胎的免疫机理。方法通过对溴隐亭致ｓＤ大鼠流产模 型组织形态、母胎界面滋养细胞凋亡因子ＣＤ９５分子及其配子（Ｆａｓ／ＦａｓＬ）、增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）、 人肝素结合性表皮生长因子（ＨＢ—ＥＧＦ）及妊娠免疫调节因子孕激素受体（ＰＲ）、催乳素（ＰＲＬ）、孕酮 （Ｐ）、辅助性Ｔ细胞Ｔｈｌ／Ｔｈ２的变化，观察菟丝子总黄酮高、低剂量组、达芙通组各项指标的变化，免 疫组化法检测胎盘和蜕膜Ｆａｓ／ＦａｓＬ、ＰＣＮＡ、ＨＢ—ＥＧＦ、ＰＲ的表达；ＲＴ—ＰＣＲ法检测蜕膜Ｔｈｌ／Ｔｈ２ ｍＲ— ＮＡ的表达。结果菟丝子高、低剂量治疗组、达芙通组胎仔数、ＨＢ—ＥＧＦ、ＰＣＮＡ、白细胞介素４（ＩＬ一 ４）、白细胞介素１０（ＩＬ—１０）ｍＲＮＡ及ＰＲ表达显著高于流产模型组，流产率、Ｆａｓ／ＦａｓＬ、 肿瘤坏死因 子（ＴＮＦ一 ）、 干扰素（ＩＦＮ一 ）ｍＲＮＡ表达显著低于流产模型组，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５或 Ｐ＜０．Ｏ１）；组织形态学方面，菟丝子总黄酮高、低剂量组及达芙通组与流产模型组比较，胎盘绒毛和 血管较丰富，密度较大，形状规则，血管相对较薄，管腔相对稍大，血管合体细胞绒毛较模型组增加，管 腔较规则，镜下形态较接近于正常组。结论菟丝子助孕安胎的机理可能通过调节母胎界面的内分 泌一免疫网络分子水平的平衡，使其恢复到正常妊娠状态而起到保胎的作用。 【关键词】 自然流产；菟丝子总黄酮（ＴＦＣＣ）；免疫 【中图分类号】Ｒ７１４．２１ 【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７３—６６１３（２０１１）１０—０８３７—０５ Ｅ ｃｔ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｓｃｕｔａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｂａｌａｎｃｅ Ｆａｃ． ｔｏｒｓ ｏｆ Ｍａｔｅｒｎａｌ Ｆｅｔｕｓ ｉｎ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ ＬＩＵ Ｈｕａ ，ＷＥＩ Ｂｉｎｇ—ｈｕａ ，ＭＡ Ｈｏｎｇ—ｘｉａ ，ＬＡＩ Ｍａｏ—ｈｕａ ，ＳＯＮＧ Ｘｉｎｇ—ｈｕａ ，ＹＯＵ Ｚｈａｏ—ｌｉｎｇ ，ＣＨＥＮ Ｙｕ—ｌｉａｎ ，ＸＩＥ Ｊｕｎ ，ＤＩＮＧ Ｔａｏ ，ＺＨＥＮＧ Ｙａｎ—ｈｕａ （１．Ｎｏ．１ Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０１２０；２．Ｎｏ．１ Ａｆｉｌｆｉａ— ｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ Ｙａｔ—ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５ １０７００；３．Ｈｕｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ Ｃｈｉ— ｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈａｎｇｓｈａ Ｈｕｎａｎ ４１０２０８） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｅｕｓｃｕｔａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｏｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ａｎｄ ｆｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｓｃａｒｒｉａｇｅ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ＳＤ ｒａｔ ｉｎ— ｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂｒｏｍｏｃｒｉｐｔｉｎｅ，ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ＣＤ９５ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ—ｆｅｔａｌ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｇａｍｅｔｅｓ（Ｆａｓ／ＦａｓＬ），ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ），ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｒｉｎ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＨＢ—ＥＧＦ）ａｎｄ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ（Ｐ）ａｎｄ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ（Ｔｈｌ／Ｔｈ２）ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ａ ｈｉｇｈ—ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ａ ｌｏｗ—ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｃｕｓｃｕｔａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（ＴＦＣＣ）ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ａ ｄｙｄｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｔａｂ— ｌｅｔｓ ｇｒｏｕｐ．ＩＨＣ ａｓｓａｙ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｆａｓ／ＦａｓＬ．ＰＣＮＡ．ＨＢ—ＥＧＦ ａｎｄ ＰＲ ｉｎ ｄｅ— ｃｉｄｕａｓ ａｎｄ ｐｌａｃｅｎｔａ．ＲＴ—ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｌ￣ｎｉｎｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｌ／Ｔｈ２ ｍＲＮＡ ｉｎ ｄｅｃｉｄｕ— ａｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ ＴＦＣＣ ｈｉｇｈ—ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＴＦＣＣ ｌｏｗ—ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｄｙｄｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｔａｂｌｅｔｓ ｇｒｏｕｐ． ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆｆｅｔｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＢ—ＥＧＦ，ＰＣＮＡ，ＩＬ一４，ＩＬ一１０ ｍＲＮＡ ａｎｄ ＰＲ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｈｉｇｈｅｒ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｍｉｓｃａｒｒｉａｇｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５ ｏｒ Ｐ＜０．０１）． Ｉｎ ｔｅｒｍｓ ｏｆ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｓｃａｒｒｉａｇｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｉｎ ＴＦＣＣ ｈｉｇｈ—ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＴＦＣＣ ｌｏｗ—ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｄｙｄｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｔａｂｌｅｔｓ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｒｉｃｈ ｉｎ ｐｌａｃｅｎｔａ ｖｉｌｌｉ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ，ｈｉｇｈ ｉｎ ｄｅｎｓｉｔｙ，ｒｅｇｕｌａｒ ｉｎ ｓｈａｐｅ，ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｔｈｉｎ ｉｎ ｖｅｓｓｅｌ ａｎｄ ｌａｒｇｅｒ ｉｎ ｌｕｍｅｎ．Ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ 基金项目：广东省自然科学基金（Ｎｏ．５３００９９７）；广州市卫生局资助研 究项目（Ｎｏ．２００５Ａ０４１） 作者单位：１．中山大学附属第一医院，广东中山５１０７００；２．广州医学 院第一附属医院，广东广州５１０１２０；３．湖南中医药大学，湖南长 沙４１０２０８ 通讯作者：马红霞，Ｅｍａｉｌ：ｄｒｌｉｕｈ＠１２６．ＣＯｉｇｌ ・８３８・ 世界中西医结合杂志２０１１年第６卷第ｌＯ期Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１，Ｖｏ１．６，Ｎｏ．１０ ｖｉｌｌｉ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｕｍｅｎ ｗａｓ ｒｅｇｕｌａｒ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｑｕｉｔｅ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ｔｈａｔ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｕｓｃｕｔａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｒｅｃｏｖｅｒｓ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｆｅｔｕｓ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ——ｉｍｍｕｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｍａ。・ ｔｅｒｎａｌ—ｆｅｔａｌ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｍｉｓｃａｒｒｉａｇｅ；Ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｓｃｕｔａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（ＴＦＣＣ）；Ｉｍｍｕｎｅ 自然流产是妇产科的常见病、多发病，严重影 响女性生殖健康。其病因复杂，其中因母胎界面内 表１特异引物的基因序列 引物 大鼠０一ａｃｔｉｎ引物（３１４ ｂｐ） 大鼠ＩＬ一４引物（２７５ｂｐ） 基因序列 ５ 一ｔｅｅ ｔｇｔ ｇｇｃ ａｔｃ ｃａｃ ｇａａ ａｃｔ一３ 分泌一免疫网络紊乱所导致的流产占８０％¨ 。菟 丝子为补肾安胎代表方寿胎丸的君药，现代药理研 究证实，黄酮类化合物为其主要化学成分 。本课 ５ 一ｔｇａ ｃａｇ ｇｔｇ ｇｃｇ ｔｔｔ ａｃｇ ａａｇ一３ ５ 一ａｇｔ ＣＲＣ ｃｇａ ｇａｔ ｇｔｔ ｔｇｔ ａｃｅ一３ ５ 一ｔｔｔ ｃａｇ ｔｇｔ ｔｃｔ ｇａｇ ｃｇｔ ｇｇａ一３ 题组经过近３年的研究发现，菟丝子总黄酮（ＴＦＣＣ） 可降低流产模型的流产率，逆转流产胎盘、蜕膜结 构的病理改变 Ｊ，同时能提高孕激素水平，促进蜕 膜孕激素受体的表达，调节Ｔｈｌ／Ｔｈ２型细胞因子平 衡的作用，改善蜕膜、滋养细胞凋亡和增殖状态，提 示ＴＦＣＣ可能是菟丝子补肾安胎的主要药效物质基 础，现将研究内容报道如下。 材料和方法 一、实验材料 １．实验动物：６９只清洁级ＳＤ大鼠，雌性ｌ０～１２ 周龄，体重２００—２３０ ｇ；雄性１４周龄，体重２３０～２５０ ｇ。购自广州中医药大学实验动物中心，动物许可证 号：ＳＹＸＫ（粤）２００３—０００１。 ２．主要仪器：恒冷切片机（英国ＳＨＡＮＤＯＮ， ＡＳ６２ＯＥ），双目显微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０Ｆ一３）， 凝胶成像分析系统（ＫＯＤＡＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓ． ｔｅｒｎｓ英国Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ），ＰＣＲ扩增仪（ＵＳＡ）， ＲＮＡ／ＤＮＡ纯度检测仪（ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ英国 Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。 ３．药品与试剂：溴隐亭（Ｓｉｇｍａ公司），每瓶１００ ｍｇ，纯晶体；达芙通（１０ ｍｇ地屈孕酮）为雅培公司 的产品，批号：３３２２６９；菟丝子总黄酮的提取制备：在 室温下，用３０ Ｌ甲醇渗漉５ ｋｇ菟丝子种子的干粉， 提取液经减压蒸干后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙 酯、正丁醇萃取。蒸干乙酸乙酯相后分别上硅胶柱 与聚酰氨柱，得到有活性的干粉６．５ ｇ，约占总质量 的０．１３％。ＰＣＮＡ、Ｆａｓ、ＨＥ—ＥＧＦ免疫组化单克隆 抗体（美国Ｒ＆Ｄ公司），Ｓ—Ｐ免疫组化试剂盒（北 京中山生物技术有限公司）。ＰＲ免疫组化单克隆 抗体（美国Ｒ＆Ｄ公司），Ｓ—Ｐ免疫组化试剂盒（北 京中山生物技术有限公司）。ＴＲＩｚｏＬＲＮＡ抽取试剂 盒（ＧＩＢＣＯ公司），ＲＴ—ＰＣＲ反应试剂盒（ＴａＫａＲＡ 公司），特异引物均由上海生工合成。特异引物的 基因序列见表１。 大鼠ＩＬ一１０弓『物（３４６ｂｐ） ５ 一ｔｇｃ ｃｔｔ ｃａｇ ｔｃａ ａｇｔ ｇａａ ｇａｃ一３ ５ 一ａａａ ｃｔｃ ａｔｔ ｃａｔ ｇｇｃ ｃｔｔ ｇｔａ一３ 大鼠ＩＦＮ一 引物（２８７ｂｐ） ５ 一ｇｇａ ｔａｔ ｃｔｇ ｇａｇ ｇａａ ｃｔｇ ｇｃａ～３ ５ 一ｇｅｔ ａｇａ ｔｔｃ ｔｇｇ ｔｇａ ｃａｇ ｃｔｇ一３ 大鼠ＴＮＦ—Ｏｔ引物（４６８ｂｐ） ５ 一ｃｇａ ｇｔｇ ａｃａ ａｇｃ ｃｃｇ ｔａｇ ｃａ一３ ５ 一ｇｇａｔｇａ ａｃａ ｃｇｃ ｃａｇｔｃｇ ＣＣ一３ 二、实验方法 １．溴隐亭致大鼠流产模型的建立、分组及处理： 将交配后受孕鼠随机分为五组，Ａ组（正常对照 组），１２只；Ｂ组（溴隐亭模组），１２只，大鼠流产模 型的建立，参照文献［１］方法，在孕６～８ ｄ时皮下注 射溴隐亭０．３ ｍｇ・ｋｇ～・ｄ～；Ｃ组（ＴＦＣＣ高剂量 组），１５只，孕１—１１ ｄ按成人临床日用量的１０倍 （５．２ ｍｇ・ｋｇ～・ｄ～，４ ｇ・ｋｇ～・ｄ ）灌胃，同时 孕６～８ ｄ时皮下注射溴隐亭；Ｄ（ＴＦＣＣ低剂量组）： 孕１～１１ ｄ按成人临床日用量的５倍（２．６ ｍｇ・ ・ｄ～，２ ｇ・ｋｇ。。・ｄ ）灌胃，其他同Ｃ组；Ｅ （达芙通组），１５只，模型组基础上，孕６～１１ ｄ以３ ｍｇ・ｋｇ～・ｄ 的剂量灌胃给药。 ２．胎盘及蜕膜的采集及观察：妊娠第１２ ｄ处死 各组孕鼠，取胎盘和蜕膜组织放入１０％甲醛固定液 中进行固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋 切片，切片厚度约５ ｍ，常规苏木素、伊红染色，树 脂封片，于普通光学显微镜下观察。剩余部分胎盘 组织，用小号组织剪刀分离着床部位的蜕膜组织， 用预冷的ＰＢＳ冲冼后，置液氮中保存。 ３．血清催乳素（ＰＲＬ）、孕酮（Ｐ）测定：于孕１２ ｄ 以腹主动脉抽血采集外周血提取血清，以ＲＩＡ法测 定激素，批内误差小于５％，批间误差小于１０％。具 体操作：按照ＰＲＬ、Ｐ放免试剂盒操作说明执行。 ４．Ｆａｓ、增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）、肝素结合性 表皮生长因子（ＨＢ—ＥＧＦ）及蜕膜孕激素受体（ＰＲ） 的检测：（１）采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白一 过氧化物酶染色法（Ｓ—Ｐ免疫组化法）。标本从液 氮中取出，复温到一２０℃，ＯＣＴ包埋，连续制备厚３ ｍ的冰冻切片，室温干燥后４℃丙酮固定１０ ｒａｉｎ。 世界中西医结合杂志２０１１年第６卷第１Ｏ期Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１．Ｖｏ１．６．Ｎｏ．１０ ・８３９・ Ｆａｓ、ＰＣＮＡ的一抗均为羊抗鼠的多克隆抗体（美国 ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司的产品）。Ｓ—Ｐ免疫组化法，一抗用 ＰＢＳ稀释，染色步骤参照说明书进行。ＰＢＳ代替一 抗作阴性对照。（２）图像分析：显微镜下观察，摄取 图像，用ＢＳＴ一２０一Ｍ全自动图像分析系统（英国） 进行病理图像分析，各组每个标本连续切片后随机 选取３张切片，每张切片在４００倍光镜下随机取５ 个视野观察，分别计算每个视野的阳性强度均值和 阳性面积，最后计算均值ｕ 均值（Ｕ ＝光镜倍数Ｘ 阳性强度均值Ｘ阳性面；￣／２６０ ０００）。 ５．蜕膜Ｔｈｌ／Ｔｈ２ ｍＲＮＡ的表达：（１）总ＲＮＡ的 抽提，按ＴＲＩｚｏＩ试剂说明书操作；（２）ＲＴ—ＰＣＲ程 序反应系统：ＭｇＣ１２ ６ Ｌ，１０ Ｘ ＲＮＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ８ ，目标基因上游和下游ｐｒｉｍｅｒ各１ ＩｘＬ，Ｔａｑ ０．５ ，加ＤＥＰＣ处理水总体积为６Ｏ 。反应条件：预 变性温度９５℃５ ｍｉｎ一个循环，然后变性温度 ９５ ｃ【＝１ ｍｉｎ，退火温度５６℃（ＩＬ一４为５８℃）１ ｍｉｎ （Ｂ—Ａｃｔｉｎ ５４℃，ＴＮＦ一仪６０℃，ＩＬ一４为５０ ｏＣ）扩 增４０个循环，７２℃延伸１ ｒａｉｎ，最后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。（３）图像获取及分析：电泳结束后，将凝胶置 紫外观察暗箱观察，若在各项目的片断位置出现橙 黄色条带与ＤＮＡ标准所处位置相同，则结果为阳 性，说明有ｍＲＮＡ表达。各电泳条带净密度按下列 公式计算：净密度值＝（平均密度一背景密度）Ｘ面 积。以所扩增Ｂ—ａｃｔｉｎ光密度作为内参，以目标基 因净密度与Ｂ—ａｃｔｉｎ净密度的比值进行半定量 比较。 三、统计学处理 统计学处理采用ＳＰＳＳ１０．０统计软件进行计量 资料组问方差分析和ｑ显著性检验。 结 果 １．各组孕鼠妊娠结局比较：结果见表２。 表２各组孕鼠妊娠结局的比较 注：与Ｂ组比较， Ｐ＜０．０１ 表１结果表明，模型组流产率显著升高，胎仔总 数、平均胎仔数明显降低，菟丝子总黄酮高、低剂量 组均可明显降低流产率，增加妊娠率，提高胎仔成 活率及胚胎数量，与模型组比较，差异有统计学意 义（Ｐ＜０．０１），且呈现一定的量效关系，其作用与孕 激素达芙通相似（Ｐ＞０．０５）。 ２．各组巨检变化：剖检见，模型组胎仔数减少， 部分流产后表现子宫水肿子宫呈结节状水肿样改 变，肌壁薄，有较多的胎仔吸收点，部分呈瘀血状， 含凝血块，胚胎较小，菟丝子总黄酮高、低剂量组及 达芙通组胎鼠均为淡红色，呈大的结节状，胚胎发 育较好，呈密集的串珠状，无瘀血水肿，与正常孕鼠 组形态相似。 ３．各组胎盘光镜变化比较：正常组子宫蜕膜较 厚，细胞呈单层高柱状或扁平状，核排列整齐、深 染，近基底部有核空泡。腺体丰富，腺体呈圆、椭 圆，腺上皮高柱状近基底部。间质疏松较厚，细胞 核形状规则，内可见大量血管。模型组胎盘组织出 血明显，局部出现细胞变性和坏死现象，绒毛和血 管含量较低，在一个视野内，很难找到５个动脉血 管，血管密度小，形状不规则，有变形，管壁相对较 厚，管腔相对较小，具血管合体细胞膜的绒毛较正 常组低，基底膜增厚，可见较多纤维样坏死，螺旋动 脉内皮不完整，常有缺损，血管内皮增厚，管腔不规 则，基质水肿。菟丝子总黄酮高、低剂量组及达芙 通组胎盘绒毛和血管较丰富，密度较大，形状规则， 血管相对较薄，管腔相对稍大，血管合体细胞绒毛 较模型组增加，较少纤维样坏死，螺旋动脉含量丰 富，血管内皮基本完整，血管内膜无明显增厚，无血 栓形成，管腔较规则，镜下形态较接近于正常组。 ４．蜕膜、胎盘免疫组化阳性分布情况：Ｆａｓ主要 集中于蜕膜细胞和滋养细胞的胞浆；ＰＣＮＡ主要集 中于蜕膜和细胞滋养层的胞核；ＦａｓＬ和ＨＢ—ＥＧＦ 染色只在胎盘，在蜕膜无染色，染色主要集中于滋 养细胞的胞浆。 ５．各组蜕膜、胎盘Ｆａｓ／ＦａｓＬ表达的差异比较（表 中测量值为Ｕ 值）：模型组蜕膜、胎盘Ｆａｓ／ＦａｓＬ的表 达明显高于正常组及各给药组，差异有统计学意义 （Ｐ＜０．０１），菟丝子总黄酮高、低剂量组与达芙通组 比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结果见表３。 表３各组蜕膜、胎盘Ｆａｓ／ＦａｓＬ表达的差异比较（ ±ｓ） 注：与Ｂ组比较， Ｐ＜０．Ｏ１ ６．各组蜕膜、胎盘ＰＣＮＡ表达的比较（表中测量 ・８４０・ 世界中西医结合杂志２０１１年第６卷第ｌ０期Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１，Ｖｏ１．６，Ｎｏ．１０ 值为ｕ。值）：模型组蜕膜、胎盘ＰＣＮＡ的表达均明 显低于正常组及各给药组，差异有统计学意义（Ｐ＜ ０．０１），菟丝子总黄酮高、低剂量组与达芙通组比 较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结果见表４。 表４各组蜕膜、胎盘ＰＣＮＡ表达的差异比较（ ± ） 注：与Ｂ组比较， Ｐ＜０．０１ ７．各组胎盘ＨＢ—ＥＧＦ表达的比较（表中测量 值为ｕ 值）：Ｂ组与Ａ、ｃ、Ｄ、Ｅ组比较，胎盘ＨＢ— ＥＧＦ表达差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），Ｃ、Ｄ组分 别与Ａ、Ｅ组比较，该指标差异无统计学意义（Ｐ＞ ０．０５）。结果见表５。 表５各组胎盘ＨＢ—ＥＧＦ表达的差异比较（ －４－ ） 注：与Ｂ组比较， Ｐ＜０．０１ ８．各组血清Ｐ、ＰＲＬ水平：Ｂ组与Ａ、ｃ、Ｄ、Ｅ组 比较，血清ＰＲＬ、Ｐ含量差异有统计学意义（Ｐ＜ ０．０１），ｃ、Ｄ组分别与Ａ、Ｅ组比较，差异无统计学意 义（Ｐ＞０．０５）。结果见表６。 表６各组血清ＰＲＬ、Ｐ含量（ ±ｓ，ｎｇ・ｍＬ ） ９．各组蜕膜ＰＲ的表达（免疫组化半定量方法， 表中测量值为ｕ 值）：Ｂ组与Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ组比较，蜕 膜ＰＲ表达差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），Ｃ、Ｄ组 分别与Ａ、Ｅ组比较，差异无统计学意义（Ｐ＞ ０．０５）。结果见表７。 １０．菟丝子总黄酮治疗后母胎界面ＩＬ一４，ＩＬ一 １０，ＩＦＮ一＾ｙ和ＴＮＦ一仅转录水平的变化（表中测量 值为净密度值）：ＲＴ—ＰＣＲ法结果显示，模型组蜕膜 ＩＬ一４、ＩＬ一１０含量明显低于正常妊娠组，ＴＮＦ—Ｏｔ、 ＩＦＮ一 含量明显高于正常妊娠组，差异有统计学意 表７各组蜕膜ＰＲ表达的差异比较（ ±Ｓ） 注：与Ｂ组比较， Ｐ＜０．０１ 义（Ｐ＜０．０５）；菟丝子总黄酮及黄体酮组均可上调 ＩＬ一４、ＩＬ一１Ｏ表达，下调ＴＮＦ—Ｏｔ、ＩＦＮ一 表达，与 模型组比较，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结果 见表８。 表８各组孕鼠蜕膜ＩＬ一４、ＩＬ—ｌ０、ＩＦＮ一 和ＴＮＦ—ｎｍＲＮＡ表达的｝ 较（ ±ｓ） 绢 Ｊｆ ＩＬ一４ ＩＬ—ｌＯ ＩＦＮ— ＴＮＦ— Ａ组 １２ １．２６２±０ ０５０ １．３７７±０，０８７ ０．４５０±０ ０２９ ０．７７６±０．０１９ Ｂ绢 １２ ０．８６８±０．０１６ ０．７２９－ｔ－０．０１２ ０．８１８±０．０１１ １．０５１±０．０４５ Ｃ组 １５ １．０１７±０．０１０ １．０５９±０ ０９７ ０．５７４±０．０１２ ０．８８４±０．１２１ Ｄ组 １５ １．１９８±０．０４９ １．１９８±０．１４８ ０．５９３±０．０１１ ０．８２８±０．０ｌ８ Ｅ组 ｌ５ １．１４３±０．０５８ １．０７８±０．０９１ ０．５０１±０．００６ ０．７６０±０．２２７ 注：与Ｂ组比较， Ｐ＜ｏ．０５ 讨 论 菟丝子是补肾安胎代表方寿胎丸的主要药物， 是补肾安胎的要药，在临床被广泛运用，其功用已 为长期的临床实践所证实。菟丝子黄酮类成分在 孕期所发挥的药物效应是否与孕激素相似？菟丝 子补肾安胎的药效物质基础是什么？目前未见针 对这些问题方面的报道。 １．菟丝子总黄酮对大鼠流产模型妊娠结局的影 响：本研究观察了菟丝子有效部位总黄酮对流产模 型妊娠结局的影响，结果显示，菟丝子总黄酮高、低 剂量组均可明显降低流产率，增加妊娠率，提高胎 仔成活率及胚胎数量和质量，与模型组比较有统计 学差异，且呈现一定的量效关系，其作用与孕激素 达芙通相似。 ２．菟丝子总黄酮对流产大鼠胎盘及蜕膜形态学 的影响：本研究结果显示，模型组大鼠胎盘组织出 血明显，局部出现细胞变性和坏死现象，绒毛和血 管含量低，胎盘子宫蜕膜螺旋动脉内皮细胞肿胀， 管腔狭窄，部分动脉末端闭塞。动脉管壁因纤维性 增生而增厚，管腔变窄，体现了损害与代偿并存的 组织学结构，这种病理性的螺旋动脉改变导致了胎 盘血窦的供血不足，使母胎间营养物质供给减少， 微循环障碍，代谢产物和毒素排除受阻，缺血缺氧 加重，胎盘绒毛及血管进一步损伤，采用菟丝子总 黄酮治疗后，发现其可以促进胎盘绒毛和毛细血管 内皮发育，使其面积增加，进一步改善血管形态，其 世界中西医结合杂志２０１１年第６卷第ｌ０期Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１ｌ，Ｖｏ１．６，Ｎ０．１０ ・８４１・ 作用相似于孕激素达芙通的变化。 本研究显示，模型组大鼠子宫蜕膜薄，腺体不 规则，某些呈囊性扩张，腺细胞低柱，细胞排列不整 齐，结缔组织相对增多。而菟丝子总黄酮可以不同 程度改善模型大鼠蜕膜形态及腺体分布。使子宫 蜕膜增厚，核排列整齐，腺体数目增多，腺体高度增 加，间质纤维化现象明显减轻。 ３．菟丝子总黄酮对流产大鼠母胎界面Ｆａｓ／ＦａｓＬ 表达的影响：近年研究表明，Ｆａｓ／ＦａｓＬ介导的细胞 凋亡在妊娠免疫耐受中起着十分重要的作用 Ｊ。 本研究结果发现，各组孕鼠１２ ｄ Ｆａｓ在蜕膜和 胎盘均有表达，而ＦａｓＬ仅表达于胎盘，这与Ｈｕｎｔ等 的报道一致，笔者的研究进一步发现流产大鼠蜕 膜、胎盘Ｆａｓ／ＦａｓＬ的表达明显高于正常孕鼠，菟丝 子总黄酮可下调蜕膜、胎盘Ｆａｓ／ＦａｓＬ的表达，与达 芙通组比较，差异无统计学意义。结合本研究组发 现菟丝子总黄酮可促使Ｐ的分泌及下调母胎界面 ＴＮＦ一 ＿５ Ｊ，推测菟丝子总黄酮降调蜕膜、胎盘Ｆａｓ／ ＦａｓＬ的表达，可能与其促使Ｐ的分泌及下调母胎界 面ＴＮＦ—ＯＬ有关，Ｐ的增加又可以通过ＴＮＦ一仪诱导 蜕膜和滋养细胞Ｆａｓ表达的下降，防止母体活化的 ＴＮＦ一 对母胎的攻击，改善母胎免疫耐受。 ４．菟丝子总黄酮对流产大鼠母胎界面ＨＢ— ＥＧＦ、ＰＣＮＡ表达的影响：肝素表皮生长因子（ＨＢ— ＥＧＦ）是一种强有力的刺激细胞增殖的调节因子，通 过自分泌和旁分泌增强滋养细胞的分化、侵入和增 殖 Ｊ。增殖细胞核抗原ＰＣＮＡ是一种与细胞增殖状 有关的核蛋白，一般认为它的合成表达与细胞增殖 状态有明显关系，是评价细胞增殖状态的一个客观 指标 ，同时ＰＣＮＡ还是人类绒毛细胞滋养细胞 （ｖＣＴＢ）、部分绒毛外细胞滋养细胞（ｅｖＣＴＢ）的重要 增殖标志 Ｊ。本研究结果发现，模型组滋养细胞 ＰＣＮＡ、ＨＢ—ＥＧＦ的表达明显低于正常组及各给药 组，差异有统计学意义，菟丝子总黄酮高、低剂量组 与孕激素达芙通组比较，差异无统计学意义。 ５．菟丝子总黄酮对流产大鼠Ｐ、ＰＲ、ＰＲＬ、Ｔｈｌ／ Ｔｈ２表达的影响：Ｔｈｌ／Ｔｈ２细胞因子的平衡在母胎 免疫耐受中发挥了核心作用 ，泌乳素 （ＰＲＬ）、孕酮（Ｐ）、雌二醇（Ｅ ）等在调节Ｔｈｌ／Ｔｈ２型 细胞因子平衡上发挥着重要作用 Ｊ。大量研究表 明，ＰＲＬ不单是妊娠过程中的伴随激素，它还与免 疫细胞之间存在着相互应答。 本研究发现，菟丝子总黄酮显著提高大鼠流产 模型Ｐ、ＰＲＬ水平，促进蜕膜ＰＲ的表达，同时可下调 蜕膜Ｔｈ１型细胞因子（ＩＦＮ一 、ＴＮＦ— ），上调Ｔｈ２ 型细胞因子（ＩＬ～４、ＩＬ一１０）的表达，与达芙通组比 较，差异无统计学意义。由上推测，①菟丝子总黄 酮可能通过影响妊娠黄体和胎盘ＨＣＧ／ＬＨ受体的 表达，促进黄体及胎盘的发育，使孕激素分泌增加， 最终调节内分泌达到稳态，从而在维持妊娠中起重 要作用，②菟丝子总黄酮可能一方面通过提高Ｐ的 水平间接调节Ｔｈｌ／Ｔｈ２型细胞因子的表达，另一方 面亦可能直接Ｔｈｌ／Ｔｈ２型细胞因子的表达，从 而恢复流产模型母胎界面Ｔｈｌ／Ｔｈ２型免疫的生理 平衡，形成维持正常妊娠所需的Ｔｈ２型免疫偏离，诱 导母胎免疫耐受。 综上所述，本研究通过对菟丝子总黄酮对流产 大鼠母胎界面免疫干预机制的研究，发现其在孕期 所发挥的效应与孕激素相似，菟丝子黄酮类有效部 位可能是菟丝子补肾安胎的主要药效物质基础。 参考文献 ［１］蒋立辉，归绥琪，李昆明，等．中药对溴隐亭致流产大鼠保胎机理 的实验研究［Ｊ］．中国免疫学杂志．２００２，１８（８）：１—４． ［２］叶敏，阎玉凝，乔梁，等．中药菟丝子化学成分研究［Ｊ］．中国中药 杂志．２００２，２７（２）：１１５—１１７． ［３］马红霞，尤昭玲，刘华，等．菟丝子总黄酮对大鼠流产模型妊娠结 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因子Ｆａｓ、ＦａｓＬ表达的研究［Ｊ］．中国妇产科ｌ临床杂志，２００５，６ （２）：１２４—１２７． （收稿日期：２０１１一Ｏ８一Ｏ５）
