第３７卷第２期 草原与草坪２０１７年 ７ 产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定 吴自祥，万学瑞，马亚茹，王 艳，吴 润，王 川，魏 姣，刘 磊， 张小丽，张天亮，杨润霞，贾晓蕊 （甘肃农业大学动物医学学院，甘肃兰州 ７３００７０） 摘要：通过筛选获得高产纤维素酶细菌菌株，为纤维素酶制剂研制及纤维素酶工程茵构建提供试验 材料。采用刚果红平板从牛羊粪便及腐败的玉米秸秆和木屑中分离产纤维素酶菌株，以ＤＮＳ法测定酶 活，根据酶活复筛产纤维素酶分离茵株；观察分离菌株的形态、染色与培养特性；应用１６Ｓ ｒＤＮＡ通用引 物扩增菌株基因组ＤＮＡ，测序结果提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库进行Ｂｌａｓｔ比对分析和相似性搜索，作出复筛 菌株种的鉴定。结果表明：分离获得１６株纤维素酶产量较高的细菌茵株，均为革兰氏阳性茵，茵体呈短 杆状、具中央芽孢，经１６Ｓ ｒＤＮＡ序列比对分析和相似性搜索，鉴定为１Ｏ株枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ— ｔｉｌｌｓ）、６株解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）。 关键词：纤维素酶；１６Ｓ ｒＤＮＡ；分离；鉴定；枯草芽孢杆菌；解淀粉芽孢杆菌 中图分类号：Ｑ ９３９．９９ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９—５５００（２０１７）０２—０００７—０６ 随着世界经济的快速发展，能源需求量急剧上升， 为了实现可持续发展，世界各国均在寻求新的替代能 源，如风能、核能、太阳能、生物质能等等。在各种新型 的替代能源中，纤维素燃料乙醇是公认的最具有发展 前景的能源。地球上每年光合作用可产生大于５Ｏ亿ｔ 以上的纤维素和半纤维素口］，纤维素物质是地球上分 布最为广泛、含量最为丰富的碳水化合物 ］。利用现 代生物技术将纤维素转化为乙醇等液体燃料，有希望 解决能源危机、环境污染和粮食危机等问题［３］，此外还 前利用纤维素物质生产乙醇的成本很高，缺少具有商 业应用价值的高效酶制剂。因此，开发新的高活性纤 维素酶酶制剂成为人们关注的热点，选育纤维素酶高 产菌株尤为重要。目前对纤维素酶产生菌的研究多集 中在真菌，以木霉属、青霉属和曲霉属更为常见，而对 细菌的报道较少。近２ｏ年来，随着中性纤维素酶和碱 性纤维素酶在棉纺织品的水洗工艺和洗涤剂中的成功 应用，细菌纤维素酶酶制剂也显示出良好的应用前 景【４］。从兰州市周边村庄植物秸秆、牛羊粪便、枯枝败 可以实现对农业产品剩余价值的高效利用。以纤维素 作为原料生产乙醇，产量稳定、可再生和无污染，但目 叶中筛选高产纤维素酶细菌菌株，进行分离菌株表型 特性和１６Ｓ ｒＤＮＡ序列鉴定及其酶学研究，以期获得 纤维素酶高产菌株，为纤维素酶制剂研制及纤维素酶 收稿日期：２０１６－０９—０８；修回日期：２０１６—１１—０２ 基金项目：甘肃省科技支撑计划项目（１２０４ＮＫＣＡ１０３）；甘 肃省农业生物技术研究与应用开发项目（ＧＮ— ＳＷ．２０１２—２５）；甘肃农业大学盛彤笙科技创新基 金项目（ＧＳＡＵ—ＳＴＳ－１２３２）资助 工程菌株构建提供试验材料基础。 １材料和方法 １．１材料 １．１．１样品用无菌法从兰州市安宁区黄家滩附近 作者简介：吴自祥（１９９１一），男，甘肃白银人，在读硕士研 究生。 采集腐败植物秸秆、碎木屑、牛羊粪便及枯枝落叶及土 壤等１Ｏ份样品，供纤维素酶产生细菌菌株分离。 １．１．２ 试剂 葡萄糖、刚果红、３，５－二硝基水杨酸等 万学瑞（１９７９一），女，甘肃白银人，副教授，博士， 主要从事预防兽医学研究工作。对全文有同等 贡献，并列第一作者。 Ｅ—ｍａｉｌ：３８３９２１４９９＠ｑｑ．ｔｏｍ 常规试剂均为国产分析纯；溶菌酶、细菌基因组总 ＤＮＡ提取试剂盒购于ＢｉｏＴｅｋｅ公司；Ｔａｑ酶购于康润 生物科技公司；ＰＣＲ产物回收试剂盒购于ＯＭＥＧＡ 吴润为通讯作者。 ８ ＧＲＡＳＳＬＡＮＤ ＡＮＤ ＴＵＲＦ（２Ｏ １ ７） Ｖｏ１．３７ ＮＯ２ ．公司。 接种马铃薯液体培养基，置２８。Ｃ转速２００ ｒ／ｒａｉｎ摇床培 １。１．３ 培养基方法进行配制。 初筛和复筛培养基按文献［５］配方和 养７２～９６ ｈ，用细菌基因组总ＤＮＡ提取试剂盒按其操 作说明分别提取各菌株基因组总ＤＮＡ，置－－２０。Ｃ保存 初筛培养基ＣＭＣ—Ｎａ １０ ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ ２．５ ｇ， 备用；（２）菌株１６Ｓ ｒＤＮＡ序列扩增与测序设计并合成 ＫＨｚＰＯ １．５ ｇ，蛋白胨１ ｇ，酵母膏０．５ ｇ，琼脂１５ ｇ， 蒸馏水定容至１ ０００ ｍＩ ，自然ｐＨ。 产酶培养基ＣＭＣ～Ｎａ １０ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，酵母膏 １６Ｓ ｒＤＮＡ扩增通用引物。上游引物５＇－ＡＧＡＧＴＴＴ— ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ一３ ，下游引物５＇－ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣ— ＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡ一３ ，由上海生工公司合成。 ５ ｇ，ＮａＣ１ １ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．２ ｇ，蒸馏水定容 以提取的菌株基因组总ＤＮＡ为模板，分别进行 至１ ０００ ｍＬ，自然ＰＨ。 马铃薯培养基马铃薯２００ ｇ，葡萄糖２Ｏ ｇ，琼脂 １５ ｇ，１ ０００ ｍＬ蒸馏水。马铃薯切片，加水煮沸３０ ｍｉｎ，纱布过滤，加葡萄糖、琼脂，滤液补足１ ０００ ｍＬ， １２１℃灭菌备用。 １．２方法 １．２．１ 样品处理 称取样品２５ ｇ，加入到盛有２２５ ｍＬ无菌生理盐水的三角瓶中，将样品充分打散混匀， 置于３７℃恒温摇床摇动２ ｄ备用。 １．２．２ 初筛 用无菌生理盐水稀释样品溶液，取 ｌ０～～１Ｏ ３个稀释度各０．１ ｍＬ样液分别涂布于初 筛培养基平板，每个稀释度涂３个平板，２８℃培养２ ｄ。 选择长势良好的单菌落点种于初筛培养基平板，２８℃ 培养２ ｄ，用１ ｍｇ／ｍＬ的刚果红染色液染色３０ ｍｉｎ，再 用１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１溶液脱色２遍。若菌株产生纤维 素酶，在菌落周围会出现清晰的透明水解圈，挑选菌落 周围有明显透明圈的菌株继续进行纯化与复筛。 １．２．３ 纯化与复筛 将初筛选出的菌株在马铃薯培 养基上进行划线，再挑取单菌落点种于初筛培养基，经 刚果红染色仍能产生水解圈者，进行革兰氏染色与镜 检，观察其染色特性和形态特征均一性。重复上述试 验，确保获得分离菌株的纯培养物。根据水解圈直径／ 菌落直径的比值大小，选出纤维素酶酶活相对较高的 菌株，移置培养基斜面于２８℃培养１～２ ｄ，置普通冰 箱保存备用。 １．２．４ 分离茵株形态与染色及茵落形态观察 将复 筛出的分离菌株划线接种于马铃薯培养基平板，置 ２８。Ｃ培养１～２ ｄ，观察菌落形态。挑取菌落抹片、革兰 氏染色与镜检，观察分离菌株菌体形态与染色特性。 １．２．５ 分离菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析与鉴定 参 照文献［６］方法进行，进行各复筛菌株１６Ｓ ｒＤＮＡ的扩 增、测序及序列比对分析，作分离菌株种的鉴定。 （１）菌株基因组总ＤＮＡ提取 将待鉴定菌株分别 各菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列扩增。ＰＣＲ扩增体系（５Ｏ Ｌ）：模板ＤＮＡ ２ Ｌ，上下游引物各２ Ｌ，Ｔａｑ预混酶 （ＴａＫａＲａ）２５ Ｌ，水１９ Ｌ。ＰＣＲ反应条件：９４℃预变 性５ ｍｉｎ；９４℃４５ Ｓ、５５。Ｃ ４５ Ｓ、７２℃１ ｍｉｎ，共３Ｏ个 循环；７２。Ｃ延伸１０ ｒａｉｎ，４℃终止反应。取ＰｃＲ扩增产 物４ Ｌ作１％琼脂糖凝胶电泳检测。若扩增产物大 小与预期结果相符，将扩增产物纯化后送上海生工公 司测序；（３）菌株１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析与菌株鉴定 提 交各菌株１６Ｓ ｒＤＮＡ序列于ＧｅｎＢａｎｋ数据库，经Ｂｌａｓｔ 相似性搜索，获取相近典型菌株的基因序列，作出各分 离菌株种的鉴定。 １．２．６ 分离菌株产纤维素酶性质鉴定 将鉴定出的 菌株接种于装有５Ｏ ｍＬ产酶培养基容量为２５０ ｍＬ的 锥形瓶中，２８。Ｃ转速２００ ｒ／ｒａｉｎ摇床培养５ ｄ，然后 ４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｒａｉｎ收集上清液，得粗酶液。取 ０．５ ｍＬ粗酶液，分别以滤纸、ＣＭＣ—Ｎａ ］，Ａｖｉｃｅｌ 和 水杨苷吲作为底物，用ＤＮＳ方法ｍ 确定各菌株产酶 性质并测定内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、 葡萄糖苷 酶酶活，通过Ｓｐｓｓ软件处理酶活数据。 ２结果与分析 ２．１ 菌株初筛 １Ｏ份样品处理液涂布于初筛培养基分离培养，选 择单菌落点种初筛培养基平板再培养后，用刚果红染 色观察。有８６个菌落周围有明显水解圈，均为细菌菌 落，且菌落较大，直径在１０￣２０ ｍｍ。 ２．２菌株复筛 进行划线纯化培养，共获得８６株产纤维素酶细菌 菌株。再进行各菌株的产酶复筛试验，根据水解圈直 径／菌落直径之比，筛选出１６株相对酶活较高的菌株 （表１）。 ２．３菌落形态及个体形态 复筛分离株菌落呈乳白色或肉粉色，直径１０～２Ｏ 第３７卷第２期 草原与草坪２０１７年 ９ ｍｍ，大小不等，形状不一，多数扁平，边缘有的整齐、有 的呈放射状或裂叶状，表面有的湿润且粘稠、有的表面 的ＤＮＡ片段（图１）。经各菌株１６Ｓ ｒＤＮＡ序列在 ＧｅｎＢａｎｋ中作同源性检索分析，１６株分离菌１６Ｓ ｒＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中已注册参考菌株的１６Ｓ 干燥且有皱褶。革兰氏染色均为阳性，多数菌株菌体 呈短杆状，中间有芽孢生成，芽孢不大于菌体横径。 表１ １６株产纤维素酶细菌水解圈与 菌落直径比较 Ｔａｂｌｅ １ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｃｉｒｃｌｅ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｙ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ １６ ｒＤＮＡ序列同源性均高于９９％，可鉴定为１Ｏ株枯草芽 孢杆菌、６株解淀粉芽孢杆菌（表２）。用ＤＮＡ Ｓｔａｒ生 成系统发育进化树（图２）。 １ ， ４ Ｍ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ ２０００ ｂｐ １ ０００ ｂｐ ７５０ ｂｐ ５００ｂｐ ２５０ｂｐ 图１部分菌株１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ扩增 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２．４菌株１６Ｓ ｒＤＮＡ鉴定结果 ｏｆ ｓｏｍｅ ｓｔｒａｉｎｓ 试验以总ＤＮＡ为模板，用１６Ｓ ｒＤＮＡ通用引物 注：１～４．１６Ｓ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增产物；Ｍ．２ ０００ ｂｐ ＤＮＡ 分子质量标准 进行ＰＣＲ扩增其１６Ｓ ｒＤＮＡ片段，得到大小１ ５００ ｂｐ 表２ １６株细菌的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列在ＧｅｎＢａｎｋ中的ＢＬＡＳＴ分析 Ｔａｂｌｅ ２ ＢＬＡＳＴ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ １６ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ２．５菌株产纤维素酶性质的鉴定 酶活性，５株细菌具有内切葡聚糖酶和 葡萄糖苷酶 用ＤＮＳ方法测定１６株分离菌的３种纤维素酶酶 活，并通过ＳＰＳＳ软件处理酶活数据，１株细菌具有内 两种酶活性，２株菌具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶 两种酶活性，８株细菌仅具有内切葡聚糖酶活 性（表３）。 切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、 葡萄糖苷酶３种纤维素 １０ ＧＲＡＳＳＬＡＮＤ ＡＮＤ ＴＵＲＦ（２０１７） Ｖｏｌ＿３７ Ｎｏ．２ Ｃ一３ 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） １ｌ７．３６２±０．３５８ ８６．９６６±０．７７１ Ｂ－３ 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） ４．７４２±０．４２７ ２ 解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ） １ 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） １０３．００９±０．９６５ ９２．０３２士０．３７４ １８．２５１±０．８３５ Ｉ）－２ 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） Ｈ一３ 解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ） Ｈ一１ 解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）３．０５２±０．３３１ ４５．５９４土０．７２６ １０９．７６３±０．４３９ ２．２０９士０．７７４ 一 ２Ｏ．７８４±０．６７１ 一 ６．４３１±０．４１７ ４６．９５９土０．６９４ １５１．１３６±０．３３６ Ａ一１ ５ 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） 一 一 １９９．２６３￣０．７５８ ６２．４８１±０．３２６ 一 一 一 １８．２６１±０．８３２ Ｈ一２ 解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ ｃｉｅｎｓ） ７ Ｃ一２ １８．２５１士０．８７２ １１２．２９６士０．７４１ ４．７４２±Ｏ．９３６ 一 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） ５５．７２６士０．５４７ ８．１１９±０．９４２ １７６．４６６±０．３６９ ３．０５３士０．３６２ Ｊ－１ 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） 一８４．４３３土０．７２３ 一 Ｉ 一３ 解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎ优 Ｚｏｚ幻“ ｃ Ｐ ） Ｋ一２ 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） ３．０５３±０．７２９ ２４４．８５７±Ｏ．５７１ ２Ｏ．７８４±０．７５３ 一 １３２．５６±０．９４６ 一 Ｍ一１ 解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ） 注：“一”表示无酶活 一 １２７．４９４±０．４２８ — ２９．２２８±０．６６３ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＫＦ９５４５５３．１ Ｌ－３ Ｈ一２ Ｈ一３ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＫＪ１４９８ｌＯ．１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＵ３２３３６９．１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＭ０５５６０３．１ Ｍ一１ Ｇ一２ Ｈ—ｌ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＪＸ３ ｌ ６７５６．１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＱ８５３４１４．１ Ｂ—ｌ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＫＦ４９６８８６．１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＪＱ３４６０７５．１ 】一ｌ Ｂ－３ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＨＭ０５５６０２．１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＨＱ１４３５６３．１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＫＦＯ０１８３９．１ Ｇ一２ Ｂ一７ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＪＱ６９５９３Ｏ．１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧＱ８６１４６８．１ Ｂ－５ Ａ—ｌ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＫＭ３６５４６２．１ Ｃ－３ Ｋ一２ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＫＭ２２６９２４．１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＫＭ４８８３２３．１ Ｄ一２ Ｏ．８ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ（Ｘ １ Ｏ０） ０ 图２ １６株菌的１６Ｓ ｒＤＮＡ系统发育树 Ｆｉｇ．２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｃｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｏｆ １６ ｓｔｒａｎｓ 第３７卷第２期 ３ 讨论 地球上可以分解纤维素的微生物种类繁多，有真 菌、细菌、放线菌等 “ 。细菌所产生的纤维素酶最适 ｐＨ为中性至偏碱性，因其水解纤维素作用较弱，长期 以来没有得到足够的重视。但是，从环境保护和动物 营养等方面来看，对厌氧菌或兼性厌氧菌的研究尤为 重要，因为污物纤维素类的分解及饲料发酵加工等大 都在缺氧环境下进行，真菌则处于弱势地位。并且，细 菌纤维素酶对酸碱耐受性强，最适反应温度范围广，耐 高温，更有利于工业生产。 试验用刚果红染色法筛选产纤维素酶的菌，方法 简单快速，通过水解圈直径与菌落直径之比能直接反 应该菌产纤维素的能力，其原理是刚果红能与大分子 多糖结合口 。应用１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析的分子生物 学技术并结合形态学观察，能够快速准确地对菌株种 属进行鉴定。采用ＤＮＳ方法测定菌株酶活，此方法操 作简便，但其存在一定误差，可以对菌株之间的酶活相 对高低进行比较，为筛选高酶活菌株提供理论依据。 研究所筛选出的１６株菌均产芽孢，属于芽孢杆菌 属，其中，枯草芽孢杆菌是目前研究最多的产纤维素酶 细菌。试验分离出新的产纤维素酶菌株，细菌产纤维 素酶的种类较少，并不是每一株细菌均能产生３种纤 维素酶，这也是导致细菌纤维素酶活力较低的原因之 一。分离出的解淀粉芽孢杆菌Ｌ－３，与国内报道的用 相同方法筛选出的高酶活细菌菌株［１ａ－］６］相比较高，其 中ＣＭＣ酶活高达２４０．３１１ Ｕ／ｍＬ，且仍可进一步对其 优化和诱导，提高其纤维素酶活力，具有相当广阔的理 论价值和应用前景。 ４ 结论 此次研究共筛选出１６株产纤维素酶的细菌，经鉴 定均为芽孢杆菌属，１０株枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ— ｔｉｌｉｓ），６株解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ— ｃｉｅｎｓ）。 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ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｃｋｓｆｏｏｔ ａｎｄ ｂｒｏｍｅ．Ｓｏｉｌ ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ａｎｄ ｃａｔａｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｉｘｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｃｋｓｆｏｏｔ ａｎｄ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ （１ｕｃｅｒｎｅ ｏｒ ｂｒｏｍｅ）ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｃｋｓｆｏｏｔ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｃｌｏｖｅｒ．Ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ ｎｏ ｐａｓｔｕｒｅ ｓｏｗｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｓｏｉｌ ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ａｎｄ ｃａｔａｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｍｏｎｇ ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｉｘｔｕｒｅ ｓｏｗｎ ｔｒｅａｔ— ｍｅｎｔｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｏｃｋｓｆｏｏｔ；ｓｏｉ１ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ；ｓｏｉｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ （上接１１页） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎ￣ａｎｄ ｉｄｅｎ ｓｃｒｅｅｎｌｎ ａｎ ｌｃＩｅ ｎｔｉｔ 一“ｉｃａｔｉ０ｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓ￣ｌＣａｔｌ０ｎ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ＷＵ Ｚｉ－ｘｉａｎｇ，ＷＡＮ Ｘｕｅ—ｒｕｉ，ＭＡ Ｙａ—ｒｕ，ＷＡＮＧ Ｙａｎ，ＷＵ Ｒｕｎ，ＷＡＮＧ Ｃｈｕａｎ ＷＥＩ Ｊｉａｏ，ＬＩＵ Ｌｅｉ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｌｉ，ＺＨＡＮＧ Ｔｉａｎ—ｌｉａｎｇ， ＹＡＮＧ Ｒｕｎ—ｘｉａ。Ｊｉａ Ｘｉａｏ—ｒｕｉ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｔｈｅ ｈｉｇｈ—ｙｉｅｌｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ．Ｓｅｐａｒａｔｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ＣＯＷ ｏｒ ｓｈｅｅｐ ｄｕｎｇ ａｎｄ ｐｕｔｒｉｄ ｍａｉｚｅ ｓｔｒａｗｓ ｏｒ ｗｏｏｄ ｃｈｉｐｓ ｗｉｔｈ Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ ｐｌａｔｅ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ＤＮＳ ａｓｓａｙ，ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅ ｉｔｓ ｓｈａｐｅ，ｄｙｅｉｎｇ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃ— ｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．１６Ｓ ｒＤＮＡ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅ ｄ ｔＯ ａｍｐｌｉｆｙ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ，ａｎｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｒｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ １ ６ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏ— ｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｇｒａｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｓｈｏｒｔ ｒｏｄ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｓｐｏｒｅｓ．Ｉｎ ｗｈｉｃｈ，１０ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，６ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；１ ６Ｓ ｒＤＮＡ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
