补肾壮骨颗粒对骨质疏松大鼠骨组织计量学的影响

补肾壮骨颗粒对骨质疏松大鼠骨组织计量学的影响

目的 观察补肾壮骨颗粒对骨质疏松症雄性与雌性大鼠的骨组织计量学的影响，探讨该药对不同性别大鼠骨质疏松症疗效差异的机制。方法 雄性大鼠只，雌性大鼠58只，各设假手术组、模型组、阳性药组及补肾壮骨颗粒高、低剂量组。采用去势方法造成大鼠骨质疏松模型。给药13周，观察不同性别各组大鼠骨组织计量学指标的变化。结果 与模型组比较，补肾壮骨颗粒高剂量组雌性大鼠骨小梁面积百分比有增加趋势（P>0.05），骨小梁数目明显增加（P＜0.05），分离度明显减少（P＜0.05）；而高剂量组雄性大鼠各指标均未见明显改变（P>0.05）。结论 补肾壮骨颗粒可改善去势造成的骨质疏松雌性大鼠模型的骨组织计量学指标，对雄性大鼠则无明显作用。

标签：补肾壮骨颗粒；骨质疏松；骨组织计量学；大鼠

骨质疏松症是绝经后妇女和老年男性的多发病，中医药在骨质疏松症的防治中发挥了重要的作用。本研究观察中医验方补肾壮骨颗粒对不同性别骨质疏松大鼠骨组织计量学指标的影响，并探讨不同性别骨质疏松症在中、西医发病机制上的差异。

1 实验材料

1.1 动物

7月龄大鼠共112只，其中雌性58只，雄性只；给药时大鼠体质量：雌性322～407 g，雄性4～663 g；广东省医学实验动物中心提供，实验动物质量合格证号：0032537。

1.2 主要药物与试剂

注射用青霉素钠、戊巴比妥钠、0.9%氯化钠注射液、蒸馏水、仙灵骨葆胶囊（贵州同济堂制药有限公司，批号080205）、补肾壮骨颗粒（中国人民广州军区广州总医院，批号071201）。补肾壮骨颗粒低剂量组用蒸馏水配成终浓度为0.083 g/mL的药液，补肾壮骨颗粒高剂量组用蒸馏水配成终浓度为0.25 g/mL的药液。仙灵骨葆胶囊剂量为1.1 g /kg（均按药粉计，按等效剂量折算法约相当于成人临床日用量的4倍）。

1.3 仪器

高分辨率专业显微数码照相机，型号：Dp71-IPp6.0，日本奥林巴斯株式会社生产。病理图像分析软件：Image-pro plus 6.0（Media Cybemetics公司，2005.10.31）。

2 实验方法

2.1 造模

随机抽取雌、雄性大鼠各12只为假手术组，其余大鼠在检疫期结束后施行去势手术。手术方法：以2%戊巴比妥钠0.20 mL/100 g（40 mg/kg）大鼠腹腔注射麻醉后（个别动物进行了0.1～0.3 mL的补充麻醉），雌性大鼠在最后一根肋骨下、脊柱旁开纵向切口，找到卵巢，将卵巢剪除（卵巢必须完整摘除不能有残留），另一侧的卵巢以同样的方式切除，术后伤口撒少量注射用青霉素抗感染。假手术组仅切除包裹卵巢的一小团脂肪组织。雄性大鼠将睾丸挤入阴囊底部，切开阴囊皮肤、内膜和总鞘膜，将睾丸挤出阴囊外，在睾丸上方精索处结扎，在结扎线下方切断精索，摘除睾丸，将精索断端退入鞘膜管内，按同样方法摘除另侧睾丸。清理阴囊切口内的血凝块后，伤口撒青霉素少量抗感染，缝合关闭切口，用2%碘酊对创口进行消毒。术后第2日开始所有大鼠连续肌注青霉素3 d，每日1次，5万U/只，预防感染。

2.2 分组及给药

除假手术组外，其余大鼠在实施去势手术后2周按体质量进行随机均衡分组：模型对照组（雌性12只，雄性12只）、阳性药（仙灵骨葆胶囊）组（雌性12只，雄性12只）、补肾壮骨颗粒高剂量组（雌性12只，雄性10只）和低剂量组（雌性11只，雄性10只）。于手术后2周每日下午各组动物按所设计的剂量给予相应的受试药物，每日1次，连续给药13周。给药后每周称量1次体质量，根据体质量调整给予的受试药物的量。假手术组、模型组给予等量蒸馏水。

2.3 观察项目及方法

骨组织计量学指标的测定：取右侧胫骨近端1/3，室温置于10%中固定24 h，流水冲洗24 h后移入10%EDTA溶液中脱钙，至骨组织无气泡发生或软化为宜，或用大头针轻轻能刺进为度，自来水冲洗24 h（脱钙过程注意避光），然后转入70%酒精内脱水3 h，再以80%酒精脱水3 h，90%、95%酒精3次脱水各1 h，100%酒精3次脱水各1 h，投入苯甲酸甲酯中透明过夜，浸石蜡50 min包埋，切片厚度5 μm。行HE染色。

在光镜10×4倍视野下，每个病理片拍1～3张（如1张病理片不能把整个胫骨的病理片视野眼全部包括，则再拍第2张，如此类推）。对胫骨上段松质骨的骨组织每张病理照片先用全自动图像分析系统直接测量（参数、单位及测量方法见表1），再通过国际通用的公式对直接测出的参数计算骨小梁面积百分数（%）、骨小梁厚度、骨小梁数量和骨小梁分离度，观察胫骨上段病理形态学变化，最后取其平均值。计算公式见表2。

3 统计学方法

所有数据均输入EXCEL2003，采用t检验进行统计处理，各组计量数据均采用—x±s表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

4 结果（见表3、表4）

5 讨论

骨质疏松症是以骨量减少、骨微观结构退化为特征的致使骨的脆性增加易于發生骨折的全身性骨骼疾病，属于“骨痿”范畴。中医认为肾为先天之本，主骨生髓，骨的生长、发育强劲与衰弱均与肾精有密切的关系。肾精的来源，一是禀赋生长；二是依赖后天气血之充养，而脾胃功能是后天气血充养的保证。故认为骨质疏松症与肾精亏虚、脾气虚弱有密切关系。同时，肾中精气不足，气虚则血运无力，渐可致血瘀，肾阳虚不能温煦推动血脉，血液运行不畅，阳虚生寒，更能凝滞血液而血瘀，进而产生全身骨及关节疼痛，故血瘀也是绝经后骨质疏松症的主要发病机制。补肾壮骨颗粒根据肾脾虚、血瘀及瘀血形成的发病机制组方。方中淫羊藿、鹿角胶、肉桂温肾壮阳、温通经脉、散寒止痛；山茱萸、龟甲胶、生地黄益肾精、补阴血；巴戟天、骨碎补肾壮阳、强骨温筋；山药、泽泻、茯苓健脾和胃益肾；三棱、水蛭活血祛瘀止痛。诸药合用，共奏补肾壮骨、健脾和胃、活血祛瘀之功效，以达到治疗骨质疏松症的作用。实验结果表明，与假手术组相比，模型组雌雄大鼠胫骨近端骨小梁面积百分数、骨小梁数目均明显减少（P＜0.01），骨小梁分离度均明显增大（P＜0.01），提示雌雄大鼠去势后均成功地复制了骨质疏松症模型。与模型组相比，补肾壮骨颗粒高剂量组雌性大鼠骨小梁面积百分比有增加趋势（P>0.05），骨小梁数目明显增加（P＜0.05），分离度明显减少（P＜0.05），骨小梁厚度无明显改变；补肾壮骨颗粒高剂量组雄性大鼠除骨小梁分离度略有减少外（-15.6%），其余指标均未见明显改变。与模型组相比，阳性药对照组雌性大鼠骨小梁面积百分比、数目均有增加的趋势（P>0.05），骨小梁分离度有减少的趋势（P>0.05），骨小梁厚度无明显改变；雄性大鼠仅骨小梁数目略有增加（P>0.05），但上述改变均无统计学意义，其余指标未见明显改變。补肾壮骨颗粒低剂量组雌雄大鼠上述骨组织计量学指标均未见明显改变。

本实验结果表明，补肾壮骨颗粒高剂量组可显著改善雌性去势大鼠的骨组织计量学指标，其疗效优于仙灵骨葆胶囊，而对雄性大鼠却无此作用，目前对这一结果尚难以给出满意的解释。近年来的临床病因学研究发现，女性绝经后骨质疏松的主导病因是雌激素缺乏，男性的睾酮对于骨形成代谢同等重要，但是雌激素在调节骨吸收方面是主导激素，女性能够应用女性激素替代或选择性雌激素受体调节剂治疗，而男性则否；女性绝经后雌激素水平进行性降低，而男性老年化过程中，血清总睾酮和总雌激素水平相对改变不大，但其生物活性成分进行性降低[2]。可见不同性别骨质疏松形成机制不同，即同样由去势造成的骨质疏松模型，雌性和雄性大鼠体内激素水平及其生物活性变化不一，对骨代谢的影响也不同。既往的研究发现补肾药物含药血清中含有类雌二醇样物质[3]，可能对雌性大鼠体内的雌激素水平有更显著的提升作用。现代药理研究发现，淫羊藿、骨碎补等补肾中药中含有黄酮类物质，其结构与己烯雌酚相似而具有雌性激素样作用[4]，其中异黄酮具有雌激素受体剂的作用[5-6]，对成骨细胞分化和增殖均有促进作用[7]；而对雄性大鼠体内雌激素的生物活性增强作用可能不显著。同时临床研究也发现，女性骨质疏松发病年龄较男性早，在同样的年龄阶段，女性患者骨质疏松较男性更严重[8]。因此推测本实验中也可能存在雌鼠较雄鼠骨质疏松更

为严重的状况，在同样按体质量给药的状态下雌鼠的骨组织计量学改善也可能较雄鼠更显著。

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