非小细胞肺癌表皮生长因子受体和ALK基因检测及其与临床病理特征的相关性

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·专题报道：肺癌·

非小细胞肺癌表皮生长因子受体和ALK基因

检测及其与临床病理特征的相关性

陈琳1

郭华1孙亚丽1徐瑞2

1

陕西省人民医院病理科（西安710068）；2

陕西省肿瘤医院内科一病区（西安710061）

【摘要】目的分析非小细胞肺癌（NSCLC）患者表皮生长因子受体（EGFR）基因突变及EML4⁃ALK融合

基因检测情况与临床病理特征的相关性，探讨其EGFR基因及EML4⁃ALK融合基因突变的意义。方法通过扩增阻滞突变系统（ARMS⁃PCR法）和RT⁃PCR法对216例NSCLC样本中EGFR基因及EML4⁃ALK融合基因进行检测。结果本研究中，EGFR基因突变率为40.7%，且多见于女性、不吸烟人群、腺癌患者及有胸膜转移者，与患者年龄、分化程度、是否有区域淋巴结转移无明显相关；多因素Logistic回归分析显示吸烟史和病理类型是EGFR突变的独立影响因素，即EGFR基因突变更易发生于不吸烟人群及腺癌患者；EML4⁃ALK融合基因突变率为6.1%，其表达状况与年龄、性别、吸烟史、肿瘤病理类型、分化程度等临床病理特征无明显相关。结论NSCLC患者中EGFR基因突变率高于EML4⁃ALK融合基因突变率，EGFR基因突变在女性、不吸烟人群、腺癌患者及有胸膜转移者中较高，其中吸烟史和病理类型是EGFR突变的独立影响因素。

【关键词】非小细胞肺癌；表皮生长因子受体；基因突变；ALK融合基因；临床病理特征DetectionofEGFRandALKgenesinnonsmallcelllungcancerandcorrelationwithclinicopathologicalfeaturesCHENLin*，GUOHua，SUNYali，XURui.*DepartmentofPathology，ShaanxiProvincialPeople′sHospital，Xi′an710068，ChinaCorrespondingauthor：XURuiE⁃mail：19628393@qq.com

detection【Abstractsignificancewithclinicopathological】ObjectiveTofeaturesanalyzeinpatientsthecorrelationwithnonofsmallEGFRcellgenelungmutationcancer（andNSCLCEML4⁃ALK），andtofusionexploregene（andEML4⁃ALKofEGFRfusiongenegeneandinEML4⁃ALK216NSCLCfusionsamplesgeneweremutationdetectedinpatientsbyAmplificationwithNSCLC.RefractoryMethodsMutationEGFRgenetheinARMS⁃PCRcorrelationwomen，non⁃smokers）andRT⁃PCR，adenocarcinomamethod.ResultspatientsMutationandpatientsrateofEGFRwithpleuralgenewas40.7%，anditwasmorecommonSystemlogisticfactorsregressionbetweenanalysisEGFRgeneshowedmutationthatsmokingandage，historydifferentiationandpathologicalandregionalmetastasis.Therewasnosignificanttypelymphwerenodetheindependentmetastasis.Multivariateadenocarcinoma.ofEGFRmutation.withMutationTheratemutationofEGFRoffusionEGFRgenegenewaswas6.1%.moreThelikelyexpressiontooccurofininfluencingEML4⁃ALKnon⁃smokersandpatientswithratenon⁃smokersofageEGFR，sexgene，smokinginpatientshistorywith，pathologicalNSCLCishighertypeofthantumorthatanddegreeofdifferentiation.ConclusionwasnotcorrelatedMutationareindependent，adenocarcinomainfluencingfactorspatientsofEGFRandpatientsofEML4⁃ALKfusiongeneanditishigherinwomen，mutation.

withpleuralmetastasis.Smokinghistoryandpathologicaltypegene【；Keyclinicopathologicalwords】non⁃features

smallcelllungcancer；epidermalgrowthfactor；genemutation；ALKfusion肺癌是世界范围内发病率和病死率最高的恶的手术时机，多数接受了手术的患者仍需要辅助

性cell肿瘤，其中约80%放化疗，而传统的放化疗对晚期NSCLC患者疗效十分有限。研究证实，胸膜侵犯、区域淋巴结转移的首选方法，lungcancer但一部分患者确诊时已错过了最佳

，NSCLC为）非，手术切除是治疗小细胞肺癌（nonNSCLCsmall等都是影响手术切除NSCLC预后的因素。近年来，随着对分子靶向治疗的深入研究，以表皮生长doi因子受体络氨酸激酶抑制剂（EGFR⁃TKI）和间变基金项目：：10.3969/j.issn.1006⁃5725.2019.11.010陕西省自然科学基础研究计划面上项目（编号：性淋巴瘤激酶抑制剂（ALK⁃TKI）为代表的分子靶2016JM8149向治疗可显著延长患者的总生存期，由于其见效通信作者：）

徐瑞

E⁃mail：19628393@qq.com

快、副作用小，目前已被批准用于EGFR/ALK基因

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检测阳性晚期NSCLC患者的一线治疗。本研究回析，多因素分析采用Logistic回归模型进行多变量顾性分析陕西省人民医院112015年6月至2017年分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

突变状态及月经手术治疗的EML4⁃ALKNSCLC融合基因检测情况，患者216例EGFR基因分析2结果

其EGFR与临床病理特征的相关性，探讨NSCLC患者2.1期指导临床诊断及治疗。

基因及EML4⁃ALK融合基因突变的意义，以EGFREGFR基因检测状况216例NSCLC是1资料与方法

15.7%主要突变率为的突变40.7%（88/216），其中19del和21L858R患者中，包括21L861Q；其他突变类型少见，类型，其突、18G719X、20S768I总的突变率仅为变率分别为20.4%、20T790M和4.6%和20ins，。1.12017总体来说，为研究对象，年一般资料11月收治并病理确诊的收集陕西省人民医院均经手术切除，术前未经任何化疗、NSCLC2015患者年2166月至例21L858R敏感突变的突变率为38.0%，包括19del突变的突变率为、18G719X1.4%、20S768I，包括和20T790M21L861Q和；、20ins原发耐药。所放疗及生物免疫治疗，收集临床病理资料，包括有患者中，具有EGFR双突变的患者共3例，分别年龄、性别、吸烟史、肿瘤病理类型、分化程度、为淋巴结转移及胸膜侵犯情况等。其中男133例，女83例；年龄30~88岁，中位年龄62岁，其中年20S768I2例19⁃del/21L858R双突变。见表1双突变以及。

1例18G719X/龄<60岁的82例，年龄≥60岁的134例；腺癌173表1NSCLC患者EGFR基因突变情况例（低分化84例，中分化65例，高分化24例），鳞Tab.1MutationofEGFRgeneinNSCLCpatients

癌37例（低分化13例，中分化22例，高分化2例），突变类型例数

突变率（%）

其他6例（包括大细胞癌1例、腺样囊性癌1例、腺敏感突变鳞癌4例）；吸烟者120例，不吸烟者96例；伴区域淋巴结转移者47例，区域淋巴结未转移者169例；19del胸膜侵犯者65例，无胸膜侵犯者151例。216例病21L858R44例中，所有病例均进行了EGFR基因检测，突变率21L861Q3420.4115.70.5为40.7%，其中有99例病例同时进行了EML4⁃ALK20S768I18G719X210.90.5融合基因检测，6例存在EML4⁃ALK融合基因突耐药突变变，突变率为6.1%。

1.2样本准备手术切除样本经10%中性福尔马20ins20T790M120.5林固定，石蜡包埋，切片厚4μm，HE染色，光镜观3

0.9双突变

察，所有样本均经两位及以上高年资病理医师复总和

40.71.4

诊，病理质控确认样本中肿瘤含量超过80%后，每例标本连续切10张（每张10μm）白片，不漂洗脱2.2NSCLC患者EGFR基因突变状况与临床病

蜡，直接封存于1.5mLEP管中备用。

理特征的关系本研究分析了216例NSCLC患者1.3基因检测方法采用EGFR基因突变定性试年龄、性别、吸烟史、病理类型、区域淋巴结转移情剂盒（厦门艾德生物医药科技有限公司）和ALK况以及胸膜侵犯情况与EGFR基因突变状态间的融合基因定性检测试剂盒（厦门艾德生物医药科关系（表2）。结果表明，女性患者EGFR突变率明技有限公司），进行EGFR基因和ALK基因检测。显高于男性（P=0.001）；不吸烟人群突变率明显检测按照试剂盒说明书，肿瘤组织石蜡切片采用高于吸烟人群（P<0.001）；腺癌患者EGFR突变率过柱法提取DNA和RNA，通过扩增阻滞突变系明显高于非腺癌患者（P<0.001）；有胸膜转移者统（ARMS⁃PCR法）对样本DNA中EGFR基因突变更易检测到EGFR突变（P=0.004）。而在关于年进行检测，RT⁃PCR方法对样本RNA中ALK基因龄、分化程度以及是否有区域淋巴结转移的分析融合进行检测。从而观察及分析EGFRNSCLC组织中中，差异均不具有统计学意义（P>0.05）。为了排除混杂因素，笔者将性别、吸烟史、病理类型以及1.4统计学方法基因突变及EML4⁃ALK采用SPSS融合基因表达状况。19.0软件进行统计胸膜转移情况纳入Logistic多因素回归分析，结果学分析，计数资料以率（%）表示，采用χ2Fisher显示，吸烟史和病理类型是EGFR突变的独立影响因素，即EGFR基因突变更易发生于无吸烟史及腺融合基因表达状况及相关临床病理信息进行分

确切概率法对EGFR基因突变和EML4⁃ALK检验或癌患者（表3）。

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表2EGFR突变状态与临床病理特征的关系者；女性突变率高于男性；无吸烟史者高于有吸烟

Tab.2RelationshipclinicopathologicalbetweenEGFRfeaturesmutationand

史者；腺癌患者高于非腺癌患者；低分化者高于例

中、高分化者，但差异均无统计学意义。另外，本临床病理特征总数

研究对EGFR阴性的患者EML4⁃ALK融合基因突野生型EGFR突变型EGFRχ2值

P值

年龄变情况进行统计，发现在EGFR阴性患者中，ALK<的突变率提高到≥6060岁岁13482

448438501.717

0.19

FR10.0%。在99例同时检测了EG⁃性别病例中，基因突变和未发现EML4⁃ALKEGFR基因与融合基因表达的EML4⁃ALK融合基因NSCLC男133共突变的患者。见表4。

女83

9137424612.0340.001

吸烟史表4ALK突变状态与临床病理特征的关系无120

50Tab.4Therelationship有96

78701834.613<0.001

clinicopathologicalbetweenfeaturesALKmutationand

例病理类型临床病理特征

例数ALK野生型ALK突变型χ2值

P值

腺癌173

37

8829.532<0.001

年龄鳞癌43585

2<0.7930.373

腺鳞癌2

310

≥6060岁岁4059375742其他2性别分化程度男

26641.3820.24

高分化871313-0.5950.552

女35623224中分化52吸烟史低分化975835无6

391

473.7950.051

其他

5

有42424260区域淋巴结转移病理类型

有169

47

103

2522660.9160.339

腺癌822.3130.315

无鳞癌15776胸膜侵犯腺鳞癌2

152

00有无

99

368.2590.004

分化程度151

652952

高分化151中分化411406.8990.032Logistic多因

低分化

4241表3

EGFR突变状态与临床病理特征关系的375素回归分析

relationshipTab.3LogisticbetweenmultivariateEGFRregressionanalysisofthe3讨论

featuresmutationandclinicopathological

早期NSCLC根治性手术是最有效的治疗手段，但一部分患者确诊时已错过了最佳的手术时B

WaldP值OR95%CI下限

上限

机，尤其是当出现胸膜侵犯或淋巴结转移时，即失吸烟史1.78714.474去根治性手术治愈的机会。对这部分患者，临床1.9996.487<0.0015.9722.378病理类型多辅以放、化疗，而传统的放化疗对晚期NSCLC患3.194

7.381胸膜1.863者疗效十分有限。近年来，分子靶向治疗因其特11.4140.0741.58514.9960.0043.687

常量

-5.4270.622

0.0110.0010.942

34.367异性高、不良反应轻，从而开启了肺癌治疗的新时代。对各类靶向分子突变患者相关临床病理特点2.3NSCLC患者EML4⁃ALK融合基因表达状况的研究有助于筛查出更多靶向治疗受益患者。目与临床病理特征的关系前EML4⁃ALK99例NSCLC患者进行了ALK融合基因突变检测，其中6例存在EML4⁃NSCLC，EGFR基因突变和EML4⁃ALK基因分子靶向治疗必要的预测指标。

最重要的两个驱动基因，也是NSCLC重排进行是变率（融合基因突变，χ2其突变率远低于EGFR基因突突变率年龄=38.998<60，岁的患者突变率高于年龄P<0.001）。EML4⁃ALK融合基因≥60岁

有酪氨酸激酶活性的糖蛋白跨膜受体，EGFR属于表皮生长因子受体家族，是原癌基

是一种具1742

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因Her⁃1的表达产物，位于7号染色体短臂的12⁃14区，与肿瘤的生长、转移密切相关。有研究［1］表EGFR提高结论的可靠性，基因突变相关。为了消除混杂因素的影响，

本研究在单因素分析基础上明EGFR，NSCLC患者中EGFR基因利用多因素Logistic多元回归分析，筛选出吸烟史和病理类型是胞凋亡。针对酪氨酸激酶，突变可持续活化EGFR⁃TKIEGFREGFR突变的独立影响因素，即的药物之一，是最EGFR促进肿瘤的增殖、其中吉非替尼先被突变而设计的特定靶向药物抑制肿瘤细成功开发为抗肿瘤靶向治疗（gefitinib）、厄洛替尼体2p23ALK基因突变更易发生于不吸烟人群及腺癌患者。

编码，是胰岛素受体超家族中的一员，正常情况下在神经系统有表达，由染色该（erlotinib）、埃克替尼（icotinib）等TKI药物可以通基因异常可导致细胞的过度增殖和细胞凋亡的下过对肿瘤细胞EGFR的特异性结合阻断细胞信号调，从而导致肿瘤的发生。EML4是棘皮动物微管转导通路，从而达到抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋相关样蛋白家族中的一员，位于2号染色体的p21亡的目的，基因片段。关，不同EGFR已被广泛应用于临床。

EGFR突变状态与突变类型对EGFR⁃TKIEGFR⁃TKI治疗疗效密切相的反应率也ALK2007年日本学者SODA融不尽相同。研究表明，TKI19del2p21合融合基因为基NSCLC的驱动基因，首次证实EML4⁃ALKEML4⁃的5，和因端倒位融合形成，2p23由）第，由2号ALK染色基因的体短臂插入引起（包括形成ALK3，端与同源或异二聚EML4基因突变与的疗效优于L858R突变患者；突变患者接受20ins和EGFR⁃T790MG719X体，引起构象变化，激活细胞内酪氨酸激酶磷酸化，活化多个细胞内信号通路，参与调解肿瘤发生反应性、EGFR⁃TKIS768I低于19del等其他突变类型患者对原发及继发耐药有关；和L858R突变患者EGFR⁃TKI而L861Q、，突变率的较与转移的多个环节［8］。所有ALK基因融合都发生低，且常常倾向于以联合突变的形式存在［2］。因此，在20号外显子编码的一段序列，而EML4断裂点深入分析EGFR突变状态及突变类型与EGFR⁃TKI则表现出多变性，目前为止，已在不同肿瘤中发现治疗疗效密切相关。临床最常见的突变类型包括19了11种EML4⁃ALK融合基因型。不同EML4⁃ALK融合基因变体酪氨酸激酶活性程度有明显差异，总突变类型的外显子缺失突变及80%~90%21外显子［3］L858R突变，约占21L858R但均具有恶性转化和致瘤能力。随后以其为有效靶组这两类经典突变约占所有是NSCLCEGFR最主。本研究中，EGFR要的突突变的变类19del型88.6%，和本（tinib点的ALK酪氨酸激酶抑制剂克20ins78/88），与以往的研究结果相一致阳性的）等靶向药物被批准用于EML1⁃ALK唑替融合基因尼（crizo⁃他突变类型，和T790M包括的突变率分别为。耐药基因21L861Q、18G719X0.9%、和20S768I0.5%。其，总否存在种族和地域差异目前尚无定论，EML4⁃ALKNSCLC治疗，融合基因在并取得了一定疗效。

NSCLC中的阳性率是西方国家的突变率为1.9%。EGFR双突变患者对EGFR⁃TKI高加索人的表达阳性率为反应率较19del和L858R单突变患者反应率低［4］，因此要特别关注，本组有3例患者存在双突变，分NSCLC别为4.6%20S768I2例19⁃del/21L858R双突变以及1例18G719X/ALK~患者阳性率为12.04%［9-10］4.1%0.4%~5%，~我国的阳性率为2.7%，亚裔人群中，99基因融合发生率略高于高加索人群。本研究。有学者认为，亚裔人群EML4⁃例NSCLC患者EML4⁃ALK融合基因阳性表据报道，双突变。

EGFR在NSCLC中的基因突变率与人达率为种有关，西方人群EGFR基因突变率为10%~20%，东亚人群EGFR基因突变率为30%~50%［5-6］，本EML4⁃ALK6.1%理因素的关系目前尚无定论。融合基因在，与文献报道结果大致相符。目前，NSCLC中的表达与临床病WANG等［11］研究中，EGFR基因突变率为40.7%，符合文献报道。以往的研究表明，EGFR突变更易发生于女4结果进行511例NSCLC通过对Meta分析后得出，患者的EML4⁃ALKEML4⁃ALK融合基因检测融合基因性、无吸烟史和腺癌人群中，但区域淋巴结转移、阳性多发生于女性、无吸烟史、腺癌患者。也有文胸膜侵犯以及肿瘤分化程度等与EGFR突变之间献报道EML4⁃ALK融合基因阳性的患者通常为年的关系尚存在争议［7］。本研究中，NSCLC患者EGFR轻、男性、无吸烟史、腺癌患者［12］。本组研究中，年基NSCLC因突变率以女性、不吸烟者、腺癌患者较龄<60岁、女性、无吸烟史、腺癌患者EML4⁃ALK融合基因突变率高于年龄≥60岁、男性、不吸烟人无胸膜侵犯者的胸膜侵犯者34.4%EGFR，且两者差异有统计学意突变率高达53.8%，高于高，群义46.8%；NSCLC区域淋巴结转移者EGFR突变率为0.05、非腺癌患者，但差异均无统计学意义（P>及EML4⁃ALK）。究其原因可能与本研究标本量不够大，以差异无统计学意义；，但与无区域淋巴结转移者的而年龄、分化程度未发现与

39.1%相比，EGFR基因突变和融合基因阳性样本量偏少有关。

EML4⁃ALK融合基因重排

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在多数情况下被认为是独立的分子事件，相互排［6］CLAYTD，RUSSELLPA，DOH，etal.Associationsbetween

斥。有学者发现在无吸烟史并且EGFR未检测到the突变的NSCLC患者，EML4⁃ALK融合基因检出率高达33%；其中34个EGFR⁃TKI耐药者有29%检出［7］EGFRIASLC/ATS/ERSZHANGandY，KRASSUNYmutationslungH，PAN［Jadenocarcinoma］Y.JPathology，etal.Frequency，2016classification，48（of1driver）：17⁃24.

andmu⁃

了EML4⁃ALK融合基因［13］。亦有研究［14］表明厄洛tationsieswithinhistologicallungadenocarcinomasubtypesandfromagefemaleatdiagnosisnever⁃smokers［J］.Clinvar⁃替H3122尼不能抑制EML4⁃ALK阳性的NSCLC细胞株［8］cerWOOResC，G2012，SEO，18（S，7）KIM：1947⁃1953.

Can⁃SW，etal.Differentialproteinstabili⁃

EGFR⁃TKI增殖，来陆续有二者共存的病例报道，原发耐药的分子因素之一。然而近年于是推测EML4⁃ALK融合基因可能是说明ALK与EGFRoustyandclinicalresponsesofEML4⁃ALKfusionvariantstovari⁃

基因突变并不是绝对彼此之间互相排斥，个别患［9］lungALKISOZAKIcancerinhibitorsH［inadvancedALK⁃rearrangednon⁃smallcell，J］ICHIHARA.AnnOncolE，，2017TAKIGAWA，28（4）：N791⁃797.

，etal.Non⁃small

者可能会有ALK与EGFR双基因突变的产生［15］。cell本研究同时对99例NSCLC病例进行EGFR基因突alectiniblungbycanceractivatingcellsalternativeacquireresistancereceptortotyrosinetheALKkinasesinhibitor变与CancerRes，2016，76（6）：1506⁃1516.

［J］.

FR双突变的病例。

EML4⁃ALK融合基因检测，未发现ALK和EG⁃［10］FRIBOULETL，LIN，KATAYAMAR，etal.TheALKinhibi⁃

tor参考文献

［11］lungceritinibWANGcancerY，［WANGJovercomes］.CancerS，XUDiscoverycrizotinibS，etal.，resistance2014Clinicopathologic，4（6in）：non662⁃673.

⁃smallcellfeaturesof

［1］PAZ⁃ARESL，TANEH，O′BYRNEK，etal.Afatinibversus

gefitinibpatientswithnon⁃smallcelllungsmall⁃cellinlungpatientscancerwith：OverallEGFRmutation⁃positivesurvivaladvancednon⁃［cancerJ］.PlosharboringOne，2014the，9EML4（10）：

⁃LUX⁃Lung7trial［J］.AnnOncol［12］e110617

ALKfusiongene：AMeta⁃analysisRENS，KUANGP，ZHENGL，ela1.Analysisofdrivermuta⁃

，，FELIP2017，dataE28，（et2from）al.：270⁃277.thephaseIIb

［2］THRESSKS，PAWELETZCPAcquiredEG⁃

FRsmallC797ScelllungmutationcancermediatesharboringresistanceEGFRT790MtoAZD9291［J］.NatinMednon，

⁃［13］carcinomationsinfemaleGADGEEL［JS］.non⁃smokerMCell，SHAWBiochemAsianABiuphyspatientsT，GOVINDAN，2012with，64pulmonary（R，2）et：155⁃160.adeno⁃al.Pooled

［3］2015HSU，F21，（NICHOL6）：560.

A，TORIUMIT，etal.Miliarymetastasesare

analysisassociatedpatientsofCNSresponsetoalectinibintwostudiesofpretreatednon⁃smallcellwithepidermalgrowthfactorreceptorstudymutations［J］.acta

inClinOncolwith，2016ALK，⁃34Positive（34）：OU4079⁃4085.

non⁃small⁃celllungcancer［J］.J

［14］COSTADB，SHAWAT，SHI，etal.Clinicalexperience

［4］OncolWEIZ，2017G，AN，56lungT（T9）cancer，：WANG1175⁃1180.

：Apopulation⁃basedZJ，etal.Patientsharboringepi⁃

withdermalsmall⁃cellcrizotiniblungincancerpatientswithadvancedALK⁃rearrangednon⁃1owergrowth2015，33（17）：1881.

andbrainmetastases［J］.JCliniOncol，

［15］GAINORJF，SHAWAT，SEQUISTLV，etal.EGFRmuta⁃

innonobjectivefactorsmallcellresponsereceptorlungcancerrate（thanEGFRwhenthose）doublewithamutationssinglemutationhadakinaseinhibitors［J］.ThoracCancertionsHAN，treatedB2014，et，al.5（withctDNA2）：EGFR⁃tyrosine

［5］RECKM，HAGIWARAK，126⁃132.determina⁃

（ratesandNSCLCto）PDALK：⁃A1retrospectivepathwayrearrangementsblockadeareassociatedwithlowresponseanalysisin［Jnon］.Clin⁃smallCancercelllungRes，cancer

2016，

tionwithofadvancedEGFRmutationNSCLC：statusTheASSESSinEuropeanstudy［andJ］.JapaneseJThoracpatients22（18）：4585⁃4593.

（收稿：2018⁃12⁃28

编辑：吴淑金）

2016，11（10）：1682⁃1689.

Oncol，