聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR），是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法，也是分子生物学实验最常用到的一种方法。根据适用对象的不同，又有荧光实时PCR、逆转录PCR等区别。本专题详细介绍了PCR实验的基本原理、步骤及常见问题的解决办法。
第一部分:PCR的基础知识
第一章:聚合酶链式反应(PCR)的历史和发展
本文章内容包括:聚合酶链反应的历史回顾、聚合酶链反应相关技术的发展、其它体外核酸扩增技术、PCR技术的应用举例。
第一节：聚合酶链反应的历史回顾 1、核酸体外扩增最早的设想
由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基 因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人 们遗忘。
2、聚合酶链反应的发明
直到1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA的体内 复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热，因此，每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus公司推 出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖金。 二、聚合酶链反应相关技术的发展
PCR及其相关技术的发展速度是惊人的。国际上分别于1988年和1990年在美国和 英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了PCR的应用 与技术本身的优化问题；第二届会议的主要议题是人类基因组计划与PCR的最新进 展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。
(表)聚合酶链反应的相关技术
名 称 简并引物扩增法 巢居PCR 复合PCR 反向PCR 单一特异引物PCR 单侧引物PCR 锚定PCR 精品文档
主要用途 扩增未知基因片段 提高PCR敏感性、特异性，分析突变 同时检测多个突变或病原 扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变 扩增未知基因组DNA 通过已知序列扩增未知cDNA 分析具备不同末端的序列 精品文档 增效PCR 固着PCR 膜结合PCR 表达盒PCR 连接介导PCR RACE-PCR 定量PCR 原位PCR 臆断PCR 通用引物PCR 信使扩增表型分型(mapping) 减少引物二聚体，提高PCR特异性 有利于产物的分离 去除污染的杂质或PCR产物残留 产生合成或突变蛋白质的DNA片段 DNA甲基化分析、突变和克隆等 扩增cDNA末端 定量mRNA或染色体基因 研究表达基因的细胞比例等 鉴定细菌或遗传作用 扩增相关基因或检测相关病原 同时分析少量细胞的mRNA 三、其它扩增技术
与PCR及其相关技术发展的同时，新的扩增技术也不断诞生。这些技术各有利 弊，与PCR互为补充，有的可结合应用，共同构成了核酸体外扩增技术的大家族。我 们相信，随着分子生物学技术的发展，这一家族一定会再涌现出新成员。
其它体外核酸扩增技术(表) 技术 转录依赖的扩增系统(TAS) 连接酶链反应(LCR) 自主序列复制(3SR)系统 链替代扩增(SDA) Qβ复制酶系统 循环探针反应 应用 检测HIV 检测点突变 研究RNA，临床应用、法医学等 检测、鉴定基因 增加探针检测敏感性 增加探针检测敏感性 ㈠连接酶链反应 (A)
连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR),是一种新的DNA体外扩增和检测 技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。是Backman 1997年为检出靶基因序列 中的点突变而设计发明，并申报了专利。
LCR的基本原理为利用DNA连接酶。特异地将双链DNA片段连接,经变性-退火-连 接三步骤反复循环,从而使靶基因序列大量扩增。
LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94℃min变性 和65℃复精品文档
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性并连接，循环30次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用 点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多 态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等。
㈡依赖核酸序列的扩增 (A)
依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA) ，又称自主序列复制系统(self-sustained sequence replication，3SR)或再生长 序列复制技术。1990年Guatelli等首先报道了这一技术。
NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序。
其基本方法为：将引物,标本加入扩增反应液，65℃1min使RNA分子二级结构打 开,降温至37℃加入逆转录酶,T7RNA聚合酶和RNase H,并在37℃反应1～1.5小时,其 产物经琼脂糖电泳，溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。
NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。
㈢转录依赖的扩增系统 (A)
转录依赖的扩增系统(Transcript-based amplification sytem，TAS)，是 Kwen等人于1989年研究报道的，主要用于扩增RNA。
TAS的主要特点是扩增效率高，因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加，只需6个 循环靶序列的拷贝数就能达到2×106。它的另一个特点是特异性高，由于TAS只能进行 6次温度循环，错掺率低，加之用葡聚糖珠夹心杂交，因而特异性也高。
虽然本法有较高的特异性和敏感性，但其循环过程复杂，需重复加入逆转录酶和 T7RNA多聚酶，有待进一步研究。
㈣Qβ复制酶反应 (A)
Kacian等于1972年首次报报Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板的自我 复制功能，它能在常温30min，将其天然模板MDV-1RNA扩增至109。1986年Chu等报道 用生物标记的靶序列特异性探针，可与亲和素联接的MDV-1RNA杂交，经洗脱未被结合 的MDV-1后，再加入Qβ复制酶，扩增复制MDV-1拷贝，然后用溴乙锭染色检测或用同 源性的第二探针杂交。
Qβ复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶，它有3个特点：①不需寡核苷酸引物的引 导就可启动RNA的合成。②能特异地识别RNA基因中由于分子内碱基配对而形成的特有 的RNA折叠结构。③在Q β复制酶的天然模板MDV-1 RNA的非折叠结构区插入一短的 核酸序列不影响该酶的复制。 因而，如在此区插入核酸探针，则其序列照样可能被 Q β复制酶扩增。
1988年Lizardi等，将靶基因序列插进MDV-1质粒里，用T7 RNA聚合酶催化转录 出MDV-1 RNA探针，这种RNA探针可与靶序列杂交，然后洗去非杂交的探针,加入Qβ 复制酶来扩增探针，被扩增的探针又可作为模板进行扩增，并呈指数递增。其产物 按上述两种方法进行检测。现在该技术又发展了夹心杂交法，分子开关和靶依赖的复 制等技术。
四、PCR技术的应用举例：
研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结 合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成基因的构建；构建克隆 或表达载体；检测某基因的内切酶多态性
诊断：细菌(螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致 病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等)；病毒(HTLV、HIV、HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19)；寄生虫(疟疾 等)；人遗传病(Lesh-Nyhan综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等)
免疫学：HLA分裂；T细胞受体或抗体多样化的定性；自身免疫病基因作图；淋 巴因子定量 人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建(检测DNA、 多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测序，表达图谱 法医：犯罪现场标本分析；HLA-DQ 精品文档
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肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤
组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究；生态学；环境科学；实验遗 传学。 古生物学：考古与博物馆标本分析 动物学：动物传染病的诊断等 植物学：检测植物病原等
第二章：PCR的基本原理和概念
1983年美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(polymerase chain re action，PCR)，
1985年公开报道，使人们能在试管内以几小时的反应将DNA扩增10^9倍。
1987年PCR得到美国的专利权，PCR技术在生命科学中掀起了一场革命，并形成了巨大的市场，有人预言，本世纪末PCR产值可达到4x10^8美元。本章介绍PCR的原理、常用的各种PCR方法及主要应用范围。
一、基本原理
DNA在细胞中的复制是—个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、
DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。
PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。PCR的具体过程如下：
将PCR反应体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。然后将温度降至引物的Km值以下，3'端与5'端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。当将反应体系的温度升至70℃左右时，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA链。每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。理论上循环几次，就增加为2^n倍。当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。PCR扩增过程见图8-1。由于实际上扩增效率达不到2倍，因而应为（1+R）^n，R为扩增效率。
二、参与PCR反应体系的因素及其作用
参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷
酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR仪等。现对它们的作用介绍如下：
(一)模板核酸
用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，
然后再进行正常的PCR循环。核酸模板来源广泛，可以从培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本等中提取。
PCR反应时加入的DNA模板量一般为100-100000拷贝，现在的技术水平已能从单个细胞制备出相应的cDNA文库。DNA模板含量合适，可以减少PCR多次循环带来的碱基错配。
通常模板DNA用线性DNA分子，若为环状质粒，最好先用酶将其切开成线状分子，因为环状DNA复性太快。
(二)引物
引物决定PCR扩增产物的特异性与长度。因此，引物设计决定PCR反应的成败。
PCR反应中有两种引物，即5'端引物与3'端引物。5'端引物是指与模板5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指与模板3'端序列互补的寡核苷酸。对引物的基本要求有：①引物的长度过短会影响PCR的特异性，要求有16-30bp，因为4^16=4.29x10^9，已大于哺乳动物基因组3x10^9bp，保证了特异性结合；引物过长使延伸温度超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74度)，亦会影响产物的特异性。②G+C的含量一般为40％-60％。③四种碱基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌吟或嘧啶存在。尤其精品文档
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是引物3'端，不应有连续3个G或c，否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补，而影响PCR的特异性。④引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补碱基不能大于3bp。⑤两引物之间不应互补，尤其是它们的3'端不应互补。一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体。④引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。①引物3'端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3'端A影响最大，因此，尽量避免在引物3'端第一位碱基是A。引物3'端也不要是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。⑧引物5'端可以修饰，包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等，引物的设计最好以电脑软件进行指导。
反应体系中，引物浓度一般要求在O.1-0.5μmol之间。浓度太高，容易生成引物二聚体，或非特异性产物。
引物Tm值与退火温度有关，计算公式为：Tm=4(G+C)+2(A+T)。引物Tm值最好在55-80℃范围，以接近72℃为最好。
(三)耐热的TaqDNA聚合酶 1976年Chien分离出热稳定聚合酶，1986年Erlich分离并纯化了适于PCR的Tq热稳定性聚合酶，
为PCR成为实用技术奠定了基础，现已用基因重组生产。日前可用于PCR的聚合酶有多种：有从水生栖热菌中提取的Taq酶、从嗜热栖热苗中获得的Taq酶、从Litoralis栖热球菌中分离的VENT酶、及从酸热浴硫化裂片苗中分离的Sac酶，而以Taq酶用得最广泛。Taq DNA聚合酶分子量为94kD，75℃时酶比活性为150bs/酶分子，反应温度过高或过低均影响其延伸率，Taq蕾有很高的耐热稳定性。实验表明，在92.5℃、95℃、97.5℃时，其半衰期分别为40min、30min和5min。
纯化的Taq酶在体外无3'-5'外切酶活性，因而无校正阅读功能，在扩增过程可引起错配。错配碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。通常，30次循环Taq酶的错配率约为0.25％，高于Klenow酶的错配率。Taq酶在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000。应用低浓度的dNTP(各20μmol／L)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq酶的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10^-6次/（核苷酸*循环）。 Taq酶具有类似于末端转移酶的TdT的活性，可在新生成的双链产物的3'端加上—个碱基，尤其是dATP最容易加上。因此，欲将PCR产物克隆到载体上，可以用两种处理办法：一是构建dT-载体；二是用Klenow酶将3'端的A去掉，即在PCR反应后，先在99℃加热10min灭活Taq酶，调整Mg2+浓度至5-10mmol/L，加入1-2U Klenow片段，室温下作用15-20min，3'端的A即被切去，
Taq酶还具有反转录活性。在2-3mmol/L Mg2+浓度下68℃时出现类似反转录酶的活性。若有Mg2+存在，则反转录活性更佳，利用这一活性，可直接用于RNA-PCR，尤其是短片段的扩增。 以往用Taq酶进行PCR扩增，一般只能扩增小于400bp的DNA片段，经过对酶的结构与功能的改造，以及PCR方法学的改进，现已能扩增20kb以上的DNA分于。
Taq酶在PCR反应中加入的量也很重要，太少当然不好，太多一方面浪费，同时也导致非特异性扩增，通常每lOOμl反应液中含1-2.5U Taq酶为好。最好在0.5-5U范围内确定最佳酶浓度。另一个问题是，虽然Taq酶是热稳定性较好的工具酶，也应注意在-20℃贮存。
(四)缓冲液
缓冲液提供PCR反应合适的酸碱度与某些离子，常用10-50mmol/L。Tris-HCI(pH8.3-8.8)缓冲液。
缓冲液中含有50mmol/L KCl有利于引物的退火。有人并加入小牛血清白蛋白(100μg/L)或明胶(0.0％)或Twen20(0.05％-0.1％)或二硫基苏糖醇(DDT，5mmol/L)等，认为这些物质可以保护Taq酶。
(五)Mg2+Taq酶的活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，Taq酶活力显暑降低；Mg2+浓度过高，又
使酶催化非特异性扩增。Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的生成等。Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，而PCR反应体系中，dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+的游离浓度。因此，Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2-0.25mmol/L。如果反应体系中含有EDTA等螯合剂，也可结合掉一部分Mg2+。
为了获得Mg2+的最佳浓度，可用下面的优化法。首先在PCR缓冲液小不加入Mg2+，从配置的精品文档
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10mmol/L的Mg2+储存液中取一定量加入到各反应管中，开始以0.5mmol/L的浓度梯度递增
(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,……5.0mmol/L)，由PCR反应后的电泳结果可确定Mg2+大概浓度范围，再在该浓度的上下以0.2mmol/L递增与递减几个浓度来精确确定Mg2+最适浓度。
(六)dNTP
dNTP为PCR反应的合成原料。每种dNTP浓度应相等，通常的浓度范围为20-200gmol/L，在此范
围内，PCR产物的量、反应的特异性与忠实性之间的平衡最佳。例如，当每种dNTP为20μmol/L时，理论上可以产生2.6μg的400bp的DNA。使四种dNTP的浓度保持在其Km值(10-15μmol/L)以上，可保持碱基掺入的忠实性；若dNTP的浓度大于50mmol/L，则可抑制Taq酶的活性。
(七)反应温度和循环次数 1．变性温度与时间
PCR反应中变性这一步很重要，若不能使模板DNA和PCR产物完全变性，PCR反应就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的变性温度愈高。太高的变性温度和时间又会影响Taq酶的活性，通常的变性温度和时间分别为95℃、30s，有时用97℃、15s。虽然DNA链在变性温度时两链分离只需几秒钟，但反应管内部达到所需温度还需要一定的时间，团此要适当延长时间。为了保证模板DNA能彻底变性．最好为7-10min，然后在以后的循环中，将变性步骤设为95℃/min。 扩增100-300bp短片段时，还呵以用快速的两步PCR法，即变性(94-97℃)、退火及延长(55-75℃)。 为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管内加入1-2滴液体石蜡。 2．复性温度和时间
复性温度决定PCR的特异性，合适的复性温度应低于引物Tm值的5℃。退火温度过低，引起非特异性扩增；增高退火温度，可提高扩增的特异性，因此要严格规定退火温度。退火反应时间一般为1min。 在PCR开始的头一次循环时，反应从远低于Tm值的温度开温，由于Taq酶在低温时仍具有活性，这时就可能因引物与模板非特异性配对面出现非特异性产物或出现引物二聚体 然后在以后整个PCR反应中，非特异性产物反复扩增，而使PCR严重失败。为了尽量消除这种非特异性扩增，可以使用热起动的方式，热起动方法有几种：一种方法是在PCR系统中加入抗Taq酶抗体。抗体与Taq酶结合，使Taq酶活性受抑制。因此在开始时，虽然温度低，引物可与与模板错配，但因Taq酶没有活性，不会引起非特异性扩增；当进行热变性时，抗体在高温时失活，Taq酶被释放，就可发挥作用，在以后的延伸步骤进行特
异的DNA聚合反应。另一种热起动法是用石蜡将Taq酶与PCR反应系统分隔，因此一开始在室温条件下也没有非特异性扩增。当升温到热变性温度下，石蜡熔化，Taq酶与PCR反面系统混合，从而在以后的步骤中发挥作用。使用热起动可以提高PCR扩增的特异性。 3．延伸温度与时间
延伸温度一般为72℃左右，此时Taq酶活性为每秒钟掺入核苷酸35-100个，2kb的片段用1min已足够，若DNA片段较长，扩增时间可适当延长。延伸时间过长又可引起非特异性扩增。 4．循环次数
循环次数主要取决于最初靶分子的浓度，例如在初始靶分子为3x10^5、1.5x10^4、1x10^3和50拷贝数时，循环数可分别为25-30、30-35、35-40从40-45。过多的循环次数会增加非特异性产物量及碱基错配数。PCR反应后期，扩增产物的增加并不成为指数方式，称为平台效应。平台效应可能与下列因素有关：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例相对降低，多次循环后酶活力降低，产物浓度增高后变性不完全而影响引物延伸。
(八)PCR仪
有多种进口与国产PCR仪。仪器的升降温方式可有气体加温、水加温及电热块加温等。温度、循环次数及时间等参数现多用电脑控制。可根据需要选择仪器。 由于PCR方法高度灵敏，少量的靶分子即可扩增至无限数。因此要防止PCR扩增产物污染环境而引起以后的PCR假阳性。为此，应将PCR仪及PCR产物检测等过程与标本制备及PCR反应管的制备尽量在空间分开，最好在不同的房间进行。通常可将实验空间分为标本处理区、反应混合制备和PCR扩增区、产物分析区等。 精品文档
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第三章：引物的稀释和使用
1． Oligo DNA是以OD260单位来计算的，这是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A260的Oligo溶液定义为1 OD260单位，根据此定义，1 OD260单位相当于33μg的Oligo DNA，您可以根据此数据和您的Oligo DNA分子量，计算得到摩尔数以计算不同摩尔浓度的溶液。 2． 引物序列的分子量计算公式如下： MW=（A碱基数×312）+（C碱基数×288）+（G碱基数×328）+（T碱基数×303）-61 例如：引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG A=1 C=3 G=11 T=6 MW=（1×312）+（3×328）+（6×303）-61=6541
3． Oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法计算：Oligo DNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5，则一条Oligo DNA的分子量=碱基数×324.5。 例：您得到一管标为5 OD260的20 mer Oligo DNA 分子量=20×324.5=6490 质量数=5×33=165μg
摩尔数=165/6490=0.025μmol=25nmol
若加灭菌双蒸水400μl溶解，则浓度为25nmol/400μl=62.5μM 4． 装有引物的eppendorf管一般保存于-20℃，临用前稀释。 5． 由于Oligo DNA呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管子前请先离心10,000rpm，1min，然后再慢慢打开管盖。
6． 在装有引物的eppendorf管内加入100-500μl双蒸水，盖上管盖，充分上下振荡5-10分钟，再次离心10,000rpm，1min。
7． 计算原引物管primer的浓度（必要时测OD260核对厂家提供引物量是否正确）。 8． 计算并将应用primer稀释为10pmol/μl。
9． 标明原引物管、应用引物管、稀释方法，置-20℃保存。
第四章：Real-time PCR与RT-PCR比较
Real-time PCR与RT-PCR是两种不同的PCR方法，适用范围也不同。 Real-time PCR中文译作“实时聚合酶链反应”，是一种最新发展的定量PCR技术。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量，较以往常用的终点定量的方法更加准确。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。Real-time PCR所采用的专用PCR仪能够自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行检测，实时的记录荧光强度的改变，从而对样品的浓度进行精确的定量。
RT-PCR是Reverse transcription PCR的简称，中文译作“逆转录聚合酶链反应”，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
但二者的基本原理是相同的，即PCR技术。
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第二部分：PCR步骤
第一章
STEP 1:PCR引物设计
第一节：PCR引物设计原则
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。 ④ G+C含量在40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧ 引物5′端可以修饰。 ⑨ 引物3′端不可修饰。
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区精品文档
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域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。 在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
10.密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
第二节：PCR引物设计及软件使用技巧
张新宇，高燕宁 （中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）
摘 要：本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。在PCR引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。 关键词：PCR；引物设计
To design PCR primers with Oligo 6 and Primer Premier 5 Zhang Xinyu, Zhu Youkang, Gao Yanning
(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing,100021,China)
Abstract: The skill of PCR primer design with software is introduced in this paper. Based on the principal of PCR-primer design, the usage of two kinds of popular primer-design software was reviewed detailedly, including their merit, demerit and usage skills. It is recommended that to use Premier Primer 5 does the usual 精品文档
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automatic primers search, but Oligo 6 primers analysis. Key Words: PCR primer; design; usage skill;
自从1985年Karny Mullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一
2. 引物的自动搜索和评价分析
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。
据笔者的经验，自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。
2.1 Primer Premier 5.0的使用技巧简介 2.1.1 功能
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸（20种常见结构氨基酸中的18种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA的来源以相应的遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。 2.1.2 使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10序列，-35序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，点击
按钮，界面如下：
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进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有
三种选项，PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按
，随之出现的Search Progress窗口中显示Search Completed时，再按
，
这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
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点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口，如图所示：
该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由
变成
，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引
，只有
。
物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。 在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击
，然后修改引物序列。若要
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回到搜索结果中，则点击
按钮。
如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。
总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易使用，是一个相当不错的软件。
2.2 Oligo 6.22使用技巧简介 2.2.1 功能
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo 6.22的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2.2.2 使用（以Oligo 6.22为例） Oligo 6.22的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。 经过Windows/Tili项后的显示如图：
在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮
，选好上游引物，此时该按钮变成
，表示上游引物已选取好。
下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。ΔG值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：） 精品文档
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Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。
当我们结束以上四项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute 开发的“Primer 3”等（本网站http://210.72.11.60已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该软件的独特之处在于，对全基因组PCR的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR的用户试用。 参考文献（References）：
(1) H.A.艾得希主编,田丁等译. PCR技术——DNA扩增的原理与应用. 北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1991.
(2) 林万明著. PCR技术操作与应用指南. 北京:人民军医出版社,1993. (3) 朱平主编. PCR基因扩增实验操作手册. 北京: 中国科学技术出版社, 1992 (4) 郑仲承. 寡核苷酸的优化设计. 生命的化学, 2001,21(3):254~256. 精品文档
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(5) George H.Keller Mark M.Manak. DNA probes. 1992. (6) Oligo软件帮助文件(Oligo.HLP).
(7) Martin, F.H., Castro, M.M., and Tinoco, Jr. I. Base pairing involving deoxyinisine, implications for probe design. Nucleic Acids Res, 1985, 13: 8927~8938.
(8) Rychlik, W. and Rhoads, R.E. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucleic Acids Res, 1989,17: 8543~8551.
第三节：引物合成介绍及常见问题 1.引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。 第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？
◆ C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
◆ OPC纯化： OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。 ◆ PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。
◆ HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。
3.引物的OD数如何定量？
答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。 精品文档
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4.投诉定量不准是怎么回事儿？
答：我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有（1）生产人员定量错误。这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化规范操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数，因为无论OD数是否达到定单要求，我们都统计为工作量，没有达到OD数的，分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。一般情况下，引物都有留样。接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题。（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。这种情况很少见。（3）系统误差，我们认为10%左右为允许误差。使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。（4）用户没有能够正确理解引物OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有将OD读数，正确地转换成母液中OD数。这种情况比较常见。（5）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。
例如，验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是： 加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul, 加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2。
5.需要什么级别的引物？
答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用 一般PCR扩增 诊断PCR扩增 DNA测序 亚克隆，点突变等 基因构建（全基因合成） 反义核酸 修饰引物 引物长度要求 < 45base >45 base < 40base 20base左右 根据实验要求定 根据实验要求定 根据实验要求定 根据实验要求定 OPC PAGE OPC, PAGE OPC OPC, PAGE，HPLC PAGE PAGE PAGE, HPLC 纯度级别要求 6.最长可以合成多长的引物？ 答：引物越长，出现问题的概率就越大。我们合成过120base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
7.需要合成多少OD数？
答：根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
8.如何检测引物的纯度？
答：实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。
9.如何计算引物的浓度？
答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实精品文档
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际产量是多少。 一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。 注意：1 OD260= 33 ug/ml.
10.如何计算引物的Tm值？
答：引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。 长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中，Size = 引物长度。
Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.
11.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？
答：非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns– 62.
NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。 常规碱基分子量 Base A C G T I U Molecular Weight 313.21 289.18 329.21 304.19 314.2 290.17 常规修饰基团分子量 5’-Biotin 5’-(6 FAM) 5’-HEX 5’-TET 5’-Cy5 5’-Cy3 405.45 537.46 744.13 675.24 533.63 507.59 3’-TAMARA 3’-Dabsyl 3’-(6 FAM) 3’-Amino Modifier C3 3’-Amino Modifier C7 3’-Thiol Modifier C3 623.60 498.49 569.46 153.07 209.18 154.12 12.如何溶解引物？ 答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,精品文档
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引物在这种条件下不稳定。
13.如何保存引物？
答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。
14.合成的引物5’端是否有磷酸化
答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费。 15.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
16.测序发现引物有突变是怎么回事？
答：测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的，碱基输错的机会不多。我们有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。
引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是99%，副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的，Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体 （脱嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A，测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基G或A的缺失。 引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。
17.长链引物为什么出错的几率非常高？
答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
18.如果测序发现突变，该如何处理？
答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。
19.如果测序发现引物突变，是否有补偿？
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答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%。您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。
20.引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？
答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。
21.为什么OPC或PAGE纯化的引物，再用HPLC鉴定纯度不高？
答： 有些用户引物需要纯度特别高的引物，在使用前会将HPLC鉴定引物的纯度，常常发现引物的纯度一般在70%左右。问题来了，还有那30%是什么？ 引物纯化PAGE, 需要电泳，用缓冲液将引物浸泡出来，然后用C18浓缩，乙醇沉淀。沉淀得到的核酸物质基本引物了，除此以外，还有其他一些非核酸类物质，他们一般不会干扰引物的使用。OPC纯化也类似的情况。即使是HPLC纯化的引物，如果对成品进行分析，一般也难达到很高的纯度，引物您得到的纯品都是由制备柱过来，洗脱峰经过浓缩抽干，部分非核酸物质被富集。
22.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高?
答：主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格自然高。
23. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？
答：下列原则供您参考。
◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 ◆长度一般为18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 ◆在引物的5’端避免使用G。 ◆选用比较多的碱基C。
◆退火温度Tm控制在 68-70C左右。 有用的荧光染料参数
24.Primer设计的基本原则是什么？
答：引物设计的下列原则供您参考。 ◆引物长度一般在18-35mer。 ◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
◆如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 ◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 ◆退火温度Tm控制在 58-60C左右。
◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。
25.用软件设计的引物为什么不管用？
答：引物是否好用，能否扩增出您需要的引物，与是否用软件设计没有太多的关系。引物设计有一定的指导意见，软件就是根据这些要求设计而成。不要迷信软件给您设计的引物，软件中一些参数您可能不明白，弄错了反而麻烦。其实，PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。软件设计最大的毛病是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。有时，我们需要扩增一段基因片段，引物的设计是没有太多的选择的。 精品文档
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26.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？
答：我们多次接到类似的投诉：引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？遇到这样的投诉有时我们感到很是为难。投诉者有时心情很不好，还不听解释。 撇开其他不谈，引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？
需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。 A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions Base Composition 5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 A260/280 2.50 1.85 1.15 1.14 1.66 27.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？ 答：通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。
28.引物不纯会有什么后果？
答：引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5'端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。
29.为什么我们的引物重合了几遍都扩增不出来？
答：有些PCR扩增没有成功，怀疑是引物不好。要求我们重合，没有问题。可是有时遇到重合数次的引物PCR扩增还是不成功。这种情况的出现一般都是用户自己的原因。对于引物合成，我们只能做到合成的引物没有问题，至于您是否能够扩增出来您需要的产物，那得靠您自己对实验本身的理解和把握。我们不能杜绝我们不犯错误，但是引物合成犯同样错误的几率很小，想犯同样的错误都难。 PCR扩增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在实验时设置对照来判定原因。
如果您怀疑引物的问题，请您首先测定您溶解的引物的OD值，看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的，请您告诉我司您的引物编号，我们会复查留存样品。如不明原因，我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增，请您查找其它原因。
30.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？
答：如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）, 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。
31.引物质量好坏的判断标准是什么？
答：合成的引物和您的定单序列一致，而不是能否扩增出您所需要的产物。
32.引物是我们设计的，现在您扩不出来，我们要负责吗？
答：不负责任。我们免费为一些实验经验不足的人员，免费设计引物。引物设计好，我们都会发给您确认。设计引物时我们遵循一般的指导原则，但是设计的引物是否能够满足您的实验要求，扩增出您需要的基因片段，我们就不能保证了。我们遇到一些用户，他们讲：引物是你们设计的，也是你们合成的，我做不出，你们就要付责任。听到这样的抱怨，觉得心寒。
33.PCR扩增不出就引物有问题吗？
答：基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增精品文档
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中遇到的扩不出，扩增效率低的问题。如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增, GC含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。
引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见（1） RT-PCR。请注意，很多基因通过常规RT –PCR方法是很难不增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。（2）从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH。
34.PCR扩增有很强的非特异条带，说明引物有污染吗？
答：不能。瞧，扩增目标很弱或没有，道是非特异性条带很亮，说明引物不纯或有污染。一些用户如是说。我们曾分析过一些非特异条带，测序发现在这些非特异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。我们只能说非特异性扩增一般是模板污染（如RNA中污染基因组）或扩增条件不合适所致。
35.引物合成的价格合理吗，还有下浮的空间吗？
答：不合理。对引物合成的成本，我们做了准确的统计和评估，认为现阶段引物的价格处于一种非理性化状态，价格已基本探底。引物合成的成本主要由四部分组成：（1）合成原料 （2）设备折旧 （3）人员费用 （4）场地和水电等消耗。其中合成原料占生产成本占30%，设备折旧占30%，人员费用占20%，场地和水电消耗等20%。我们的合成成本控制是相当到位，原料管理也非常严格，原料进货成本不可能高于同行。现行的引物合成价格，已让我们感到十分吃力。我们需要对我们的用户负责，我们需要体现做人的准则，我们需要交税，我们需要收回设备的采购费用，我们需要给我们的用户提供配套服务，这些需要才使我们还在做引物合成。引物合成业务的利润空间可能还赶不上菜场上买鱼的.
第二章
STEP2:反应条件选择
第一节：PCR标准反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul
上述体系为100ul，实验中一般用50ul体系，即以上所有试剂减半。也可根据Taq酶说明书上的推荐配方。
PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 精品文档
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⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另
一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP
浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 ①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 精品文档
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70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
第二节：PCR反应条件的选择及优化
PCR技术已经在生物学研究和临床医学检验领域中得到了广泛的应用，PCR技术也日臻完善。PCR技术操作简便，特异性强，敏感度极高，正因为敏感度高，很容易受其他因素的影响，因此要得到准确可靠的反应结果，需根据不同的模板，摸索最适合的条件，配制出PCR反应试剂。
聚合酶链反应必须具备下述基本条件：①模板核酸（DNA或RNA），②人工合成的寡核苷酸引物，③合适的缓冲体系，④镁离子，⑤三磷酸脱氧核苷酸，⑥耐热DNA聚合酶，RNA反转录酶及RNA酶抑制剂（RNasin）,⑦温度循环参数（变性、复性和延伸的温度与时间及循环次数）。
1．模板的选择
PCR反应用DNA（单、双链DNA）或RNA都可以作模板进行核酸的体外扩增。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到cDNA后才能进行正常PCR扩增。核酸标本来源广泛，可以从纯培养的细胞或微生物中直接提取，也可以从临床标本（血、尿、便、痰、体腔积液、漱口水等）、犯罪现场标本（血斑、精斑、毛发等）、病理标本（新鲜或固定石蜡包埋标本）以及木乃伊标本中提取。无论标本来源如何，待扩增核酸都需部分纯化，以使核酸样品中不混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白质。虽然PCR可以仅用微量样品（甚至是来自单一细胞的DNA），但为保证反应的特异性，一般还宜用纳克级（ng）的克隆DNA、微克水平的染色体DNA或102-105拷贝的待扩增DNA片段做起始材料。
2．引物
PCR扩增产物的大小及扩增的靶序列在基因组中的位置是由引物限定的。因此，引物的选择与合成对PCR成功与否具有决定性意义。对某一DNA片段来说，由于同源顺序的存在，随意设计的两条引物链，其PCR产物经电泳分析时可能会出现多条电泳带。因此，在引物的设计过程中要考虑引物链的特异性，即它们只与被检测的DNA片断互补。
(1) 引物长度以16-30个碱基为宜，最佳20-24个bp，不会形成稳定的复合体。 (2) 有时引物不起作用，理由不明，可以移动序列位置来解决。
(3) （G+C）%含量一般40%-60%为佳，两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。
(4) 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端避免形成“引物二聚体”。如无法避免，其3’端互补不应大于2个碱基。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，避免同源序列（尤其6个以上相同）。 (5) 引物内部避免形成次级结构，尤其是发卡结构，必要时应通过计算机进行结构分析。
(6) 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端，一是易形成引物二聚体，二是当扩增微量靶目标并且起始材料又不太纯时容易产生非特异性产物。一般来说，用低浓度引物不仅经济，反应特异性也较好。
3．镁离子浓度
Mg2+浓度对PCR扩增反应的特异性和产量有着显著影响。PCR中常用的体系应Mg2+浓度为1.5mmol/L，但对不同的反应体系应优化Mg2+浓度。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物产量减少。PCR反应中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.5-2.5mmol/L。最好对每种PCR反应体系精品文档
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Mg2+量的优化。另外，还需注意引物和模板DNA原液中是否含EDTA等螯合剂影响游离Mg2+的浓度。
4．三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）
PCR反应中每种dNTP的终浓度为50-200μmol/L，在此范围内，扩增产物量、特异性与合成忠实性这间的平衡最佳，dNTP浓度过低必然影响扩增产量，过高则会导致错误掺入，其浓度不能低于10-15μmol/L。由于dNTP的量还受其他因素的影响，所以不同反应体系中dNTP的最佳浓度不尽相同。
5、TapDNA聚合酶
在其他参数最佳时，每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNa酶。然而酶的需要量可以根据不同的模板分子或引物而变化，当优化一种PCR反应体系时，最好在每100μl体积中加入0.5-5u酶的范围内试验最佳酶浓度。如酶浓度太高，会出现非特异性扩增，而过低时，则扩增产量太低。另外不同来源的Taq DNA酶、测定条件和单位定义的不同、生产厂家产品品质的优劣，这些都是使用Taq酶时需要考虑的因素。
6．温度循环参数
变性温度通常为94℃左右，主要取决于扩增片段的长度和（G+C）的比例，达不到变性温度致使变性不完全，是导致PCR失败的常见原因。变性时间一般为30-60秒，时间太长不但没有必要反而会因降低酶的活性而影响产量和反应特异性。常用PCR一般为20-40个周期，随着周期次数增加TaqDNA聚合酶活性降低，聚合时间延长，引物或单核苷酸减少等原因，会造成反应后期容易发生错误碱基掺入。所以在满足产物得率的前提下，应尽量减少周期次数。
7．石蜡油
加入石蜡油的目的是防止反应液蒸发，以免造成反应体积和成分的改变，特别是当反应体积小或反应条件严格时更应注意。反应中加入的石蜡油必须是高质量的，无菌的，不能含有抑制PCR反应中各种试剂活性的污染物，加入的体积要求不太严格，应以盖住反应液液面为度。
8．平台效应
“平台效应”是指PCR后期循环产物累积趋于饱和，使原来以指数增长的速率变成平坦的曲线，同时出现非特异产物的大量增加的现象。下列因素可能与平台效应有关： （1）dNTP或引物的消耗量。
（2）反应物的稳定度（dNTP或酶）
（3）最终产物的阻化作用（焦磷酸盐、双链DNA）。
（4）非特异产物或引物二聚体与反应物的竞争。
（5）产物在高浓度时变性不完全，影响引物的延伸。
（6）酶与PCR产物的结合，使酶分子减少。
合理的PCR循环参数，能最大限度地避免这些因素对产物扩增的影响。
第三节：PCR反应的常见问题总结
PCR 的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。今天我们把相关内容整理出来，与大家共同讨论，希望对大家能有所帮助。
一、引物设计
所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件方便些，防止你一不精品文档
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小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。设计软件有很多，既可以在线设计（如Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），也可以用Primer5、Oligo6.65 等等。
1. 引物设计的原则 细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：
1）典型的引物18 到24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
2）选择GC 含量为40％到60％或GC 含量与模板GC 含量接近的引物。 3）设计5'端和中间区为G 或C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 4）避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。在用软件设计时大家常常会疑惑,究竟? G 不能低于多少?这里有个数据: ? G 为0~-2时,PCR 产率可达100%, ? G=-6 时,为40%.
5）避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5 个核苷中含有3 个A 或T。
6）避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G或C 结尾，防止AT 的松散结合引起错配。
7）避免存在可能会产生内部二级结构如发夹结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。 8）引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度。两引物的Tm 值相差不应大于5℃。计算Tm 有几种公式。第一个公式(Wallace 规则):Tm = 4℃（g + C） +2℃（a + T）,这来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于15-20个碱基的引物,也适用于手工设计时的简单计算。第二个公式(Baldino 算法)适用于计算14-70个核苷酸在≤0.4mol\\L 的阳离子溶液中的Tm, 也可用于扩增产物的Tm 计算.Tm=81.5+16.6*lg[K+]+0.41(%[G+C])-(675/n)。以上两种算法都是基于碱基组成而不是碱基排列而计算的，事实上相同碱基组成的引物Tm 可能差异不小：GGGAA 和GAGAG 的Tm 是不一样的，所以确定引物Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序如Primer5 等均使用近邻分析法。
9）当在引物5’端添加酶切位点时要考虑：a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的粗心人。这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。b)如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。如果不设计保护碱基，则多半要用TA 克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq 酶的选择，这一点在后面再聊。若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
10）有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。特别要注意的是：不要在引物的3'端使用兼并碱基，因为3'端最后3 个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1µM 到3µM），因为许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。说了半天了,想起来还得提醒大家一句:千万别搞错了引物的位置！这句话似乎多余。仔细琢磨一下，特别是5’端再接上酶切位点可别搞错了！合成错了一条可就是50 块钱，到时候挨老板批的时候别怪我没提醒你哦：）设计好了引物就要让公司合成，这时候别忘了谈价格：）现在竞争很厉害，价格已经挺便宜了，注意两个参数：一个是OD 值，如果公司说1OD 能比2OD 优惠，那通常1OD 足够了。第二是纯度，是HPLC 的还是OPC 的，事先要说好，建议看看这里（唉，不是我给他们做广告，只是他们的说明书写得真不错）：http://www.takara.com.cn/product/cs/c_3.htm#1引物设计方面还有很多话题可说，比如如何利用引物搭桥将两个片段通过PCR 而不是酶连接起来、如果要设计引物表达蛋白时注意“N 端规则”。
二、PCR 成分
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引用《分子克隆3》提供的PCR 标准反应条件： 模板1pg-1μg 引物1μmol/L DNA 聚合酶1－5 单位 Mg2＋ 1.5mmol/L dNTPs 200μmol/L KCl 50 mmol/L
1. 模板 模板可是PCR 的关键，模板的质量是PCR 成功的先决条件，巧妇难为无米之炊嘛！怎样得到模板，这可是一个大问题，仅仅一个提取基因组DNA 就有很多的名堂，这会是我们后面专辑的内容，这里不多说啦，有问题来论坛讨论吧。P 不出东西的时候不妨先考虑：模板有没有问题？（DNA 样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA 制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。）所需的最佳模板量取决于基因组的大小。你的目的片段在基因组中占多少？至少要保证模板中含有一个单拷贝吧！100ng 到1µg 的人类基因组DNA，相当于3×104 到3×105 个分子。所以对于单拷贝基因,这需要0.1μg 的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng 的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR 可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。 2. 引物 引物以干粉形式运输。最好用TE 重溶引物，使其最终浓度为100µM。TE 比去离子水好，因为水的pH 经常偏酸，会引起寡核苷的水解。当然，如果担心TE 对于PCR 的影响，不妨用ddH2O。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10µM 浓度溶于TE 的引物在-20℃可以稳定保存6 个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1 周。干粉引物可以在-20℃保存至少1 年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2 个月。注意：溶解之前先离心一下，防止一开盖就飞了。引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1 到0.5µM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。通常跟着引物来的说明书会告诉你，关于寡核苷酸的计算可以看看这里：http://www.takara.com.cn/product/fl/i_1.htm
3. 聚合酶的选择 这可是有讲究，咱论坛里有个专题讨论这个问题。主要考虑两个方面：用途——对保真度的要求高不高？成本——高保真的酶总是会贵一些的。综合考虑一下找个平衡点吧，当然啦，该花钱的时候可不能省。Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少3'到5'外切核酸酶（校正）活性。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。在很多公司的手册中有对各种酶特性的描述，大家不妨比较一下。提醒一点：高保真酶除了我所知的Merck的Easy-A 以外，都不会在3’端加A尾巴（因为其3’-5’外切酶活性），所以做TA克隆的时候需要一点小诀窍——扩增完了再加普通Taq去加个A。另外还有个方法：将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的保真度，并可以得到高产量及扩增长模板。
4. Mg2＋浓度 镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200µM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。在多数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性（当然，也有相反的报道）。为了确定最佳浓度, 可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。
5. dNTPs 高浓度的dNTPs会对扩增反应起抑制作用。将每种dNTP的浓度从200µM降低到25-50µM可以使扩增产物获得满意的产率。
6. KCl 标准浓度为50 mmol/L, 对于较短片段可将其提高到70-100 mmol/L.
三、PCR 反应参数
1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR 失败,因为未变性完全的DNA 双链会很快复性,减少DNA 产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC 的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。 精品文档
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2. 退火：这是PCR 的一个关键参数。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm 低5℃, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。如果两个引物Tm 不同，将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。
3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb 长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
4. 循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30 轮循环扩增后, 反应中Taq DNA 聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增,可将扩增的DNA 样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60 轮循环后, 扩增水平可达109-1010。扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)n 。其中：C 为扩增产物量,C0 为起始DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。
四、提高PCR 扩增特异性
1. 递减PCR（TouchDown PCR） 递减PCR 通过在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm 高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃（当然，也可以每几个循环降1－2℃），直到退火温度低于Tm 5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR 对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP® DNA 指纹分析。
2. 热启动 热启动PCR 是除了好的引物设计之外，提高PCR 特异性最重要的方法之一。尽管TaqDNA 聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR 尤为有效。并且，热启动在很大程度上防止引物二聚的发生。限制Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR 反应液，并将其置于预热的PCR 仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA 合成，直到PCR 仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。
3. 促进PCR 的添加剂 退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC 含量的模板，需要其他的措施。影响DNA 熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR 添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution 精品文档
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可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA 聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution 还有其他优点。在同PlatinumTaq DNA 聚合酶和Platinum Pfx DNA 聚合酶一起使用时，仅需很少的镁离子优化。这样，将Platinum 技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制Taq DNA 聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。
4. 巢式PCR 使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15 到20 个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100 到1000 倍加入到第二轮扩增中进行15 到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30 到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR 可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。
五、PCR 产物测序
对于PCR 产物的测序有两个方式:
1. DNA 直接测序: 指直接分析不经分离的PCR 扩增产物,如果各个位点上碱基序列都是一致的,则所得信号是确定的,否则,在那些有相异碱基的位点出现模糊信号, 如果模板在多数情况下被正确扩增,则少数的突变将被掩盖,这是结果显示的是模板的序列.但是,当扩增的前几轮即出现错误扩增并被后续的循环积累,这时就不再反映模板的状况.
2. PCR 产物经克隆后测序: 这是对单克隆测序,其结果是反映单一扩增产物的序列,结果是确定的.
六、PCR 污染与对策
PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生. 1、污染原因
(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.
(二)PCR 试剂的污染:主要是由于在PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染.
(三)PCR 扩增产物污染.这是PCR 反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR 产物拷贝量大(一般为1013 拷贝/ml)，远远高于PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR 产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性. 还有一种容易忽视，最可能造成PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.
2、污染的监测 一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染. 对照试验：
1）阳性对照:在建立PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR 阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100 个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR 试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照. 2）阴性对照:每次PCR 实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血精品文档
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清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂对照:在PCR 试剂中不加模板DNA 或RNA，进行PCR 扩增，以监测试剂是否污染. 3）重复性试验
4）选择不同区域的引物进行PCR 扩增 3、防止污染的方法
(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR 反应液、PCR 循环扩增及PCR 产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开.最好能划分①标本处理区;②PCR 反应液制备区;③PCR 循环扩增区;④PCR 产物鉴定区. 其实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA 或RNA.
(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染.
(三)预混和分装PCR 试剂:所有的PCR 试剂都应小量分装，如有可能，PCR 反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.另外，PCR 试剂，PCR 反应液应与样品及PCR 产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱.
(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.
(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照.
(六)减少PCR 循环次数，只要PCR 产物达到检测水平就适可而止.
(七)选择质量好的Eppendorf 管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出.
4、PCR 污染解决对策（这是从另一篇文章总结而来，与前面的部分略有重复，大家随便看看吧）PCR 检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题。
一． 污染的预防 进行PCR 操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的 PCR 污染或杜绝污染的出现。 （一）划分操作区：目前，普通PCR 尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： 1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备； 2. PCR 扩增区，包括反应液的配制和PCR 扩增； 3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增? 产物分析? 产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 （二）分装试剂：PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA 和其他来源 的DNA： 1．PCR 用水应为高压的双蒸水； 2．引物和dNTP 用高压的双蒸水在无PCR 扩增产物区配制； 3．引物和dNTP 应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。 (三) 实验操作注意事项尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意： 1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； 2. 使用一次性吸头，严禁与PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； 5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； 6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性； 7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA 的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区； 8. 重复实验，验证结果，慎下结论。 精品文档
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二． 追踪污染源 如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。 （一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100 个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR 敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR 体系中各试剂的时机对照，即包括PCR 反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR 产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。 （二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。 环境污染中常见的污染源主要有： 1. 模板提取时真空抽干装置； 2. 凝胶电泳加样器； 3. 电泳装置； 4. 紫外分析仪； 5. 切胶用刀或手术刀片； 6. 离心机； 7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml 去离子水浸泡；3）取5ml 做PCR 实验；4）电泳检测结果。 8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR 产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。 三．污染处理 （
一）环境污染 1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L 盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA 脱嘌呤； 2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min 即可。需要注意的是，选择UV 作为消除残留PCR 产物污染时，要考虑PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV 照射仅对500bp 以上长片段有效，对短片段效果不大。UV 照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA 链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV 照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV 波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA 链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 链间与链内的交联和DNA 断裂等）均可终止Taq DNA 聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（ 0.13/碱基）在DNA 分子上随机分布，一个500bp片段的DNA 分子链上将有32 处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp 的片段，每条链上仅有6 处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV 照射有一定的片段长度限制的原因。
（二）反应液污染 可采用下列方法之一处理： 1. DNase I 法：PCR 混合液（未加模板和Taq 聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30min 后加热灭活，然后加入模板和Taq 聚合酶进行正常PCR 扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA 的序列； 2. 内切酶法：选择识别4 个碱基的内切酶（如Msp I 和Taq I 等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR； 3. 紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV 照射法； 4. g 射线辐射法：1.5kGy 的辐射可完全破坏0.1ng 基因组DNA，2.0 kGy 可破坏104 拷贝的质粒分子，4.0 kGy 仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR 扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g 射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA 的。
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于UV 照射的去污染作用对500bp 以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR 扩增片段通常为300bp 左右，因此UNG 的预防作用日益受到重视和肯定。 1. 原理：在PCR 产物或引物中用dU 代替dT。这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育，因UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含dU 的模板无任何影响。UNG 可从单或双链DNA 中消除尿嘧啶，而对RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。 2. dUTP 法：用dUTP 代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR 扩增前，用UNG 处理PCR 混合液即可消除PCR 产物的残留污染。由于UNG 在PCR 循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU 的新的PCR 产物。 3. dU 引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR 产物中仅5ˊ端带dU。UNG 处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。精品文档
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对长片段（1-2kb 以上）的扩增用dUTP 法效率较用dTTP低，而用dU 法就可克服这一缺点。dU 引物最好将dU 设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。 4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG 处理可以和PCR 扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU 存在，可彻底消除污染源。 5. 需注意的是掺入dUTP 的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR 产物克隆时，应该转化UNG-（UNG 缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG 消化掉。 （四） 固相捕获法 用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA 探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA 探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR 检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。 （五）RS-PCR 法（RNA-specific PCR） 也称为链特异性PCR，主要指用于RNA 模板的特异性PCR 法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR 的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端（A 区）有2 0 个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0 个核苷酸（C 区）为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使cDNA 与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR 循环中用逆转录引物的B 区和引物C 进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA 或质粒DNA 才不会被扩增。
（六）抗污染引物法 该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA 才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。 附录: 各种碱基符号
在设计简并引物或测序时你可能会碰到这样的符号来表示碱基,到时候不要不知道哦： B = C or G or T D = A or G or T H = A or C or T K = G or T M = A or C N = A or C or G or T R = A or G S = C or G V = A or C or G W = A or T Y = C or T
第三章
STEP3:结果检查与分析
第一节：PCR扩增产物的检测分析
PCR扩增反应完成之后，必须通过严格的鉴定，才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物。凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法，能判断产物的大小，有助于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者，后者主要用来检测小片段DNA。 1．琼脂糖凝胶电泳
这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。
用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。 （1）制胶
琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml 0.5×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度0.5μg/ml精品文档
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的EB液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。 （2）加样和电泳
上样时一般取PCR反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×TBE液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。 （3）检测
将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。 它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点： ①分辨率很强，可达1bp；
②能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA； ③回收的DNA纯度高；
④其银染法的灵敏度较琼脂糖中EB染色法高2~5倍；
⑤避免了EB迅速退色的弱点，银染的凝胶干燥后可长期保存。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA片段的有效范围： (1)制胶
在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。
制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。制备100μl体积凝胶的配制方法见下表。 不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法： 试剂 水（ml） 5×TBE（ml） 10%过硫酸铵（ml） TEMED（ml） 3.5% 5% 67.7 62.7 20 0.7 20 0.7 8% 12% 20% 66.6 66.6 20 0.7 30%丙烯酰胺溶液（ml） 11.6 16.6 26.6 40 26.6 40 20 0.7 20 0.7 0.035 0.035 0.035 0.035 0.035 在加入TEMED和10%过硫酸铵后，立即混匀，倒入放置45℃角的玻璃板内，完全注满（注意不要有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待30-60分钟胶聚合后，取下胶板，放入电泳槽中固定。 （2）加样和电泳
上下槽中加入1×TBE电泳缓冲液，溢过加样孔，拔出梳子，排出加样孔中的气泡，将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀，用微量注射器加入加样孔底部，使样品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的DNA Marker。
以2-10V/cm电压电泳，电泳时间足够长，使片断足以分开，待指示剂走到适宜位置时关闭电源，将胶片取出。 （3）银染
分开两块玻璃板，将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min，双蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml 0.2%的AgNO3中于摇床上染色约10min，吸去AgNO3液，用双蒸水洗3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2CO3，静置2-3min，取出凝胶观察。
第二节：PCR产物测序
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PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测 序技术相结合后，它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法。
本章主要综 述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质 粒或病毒基因组相比，直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一个不依赖于生 物体(如细菌、病毒等)的体外系统，因而它更容易标准化(即例于自化2);对于每个待 测样品，只需测定一个单链序列，因而它也就更快和更准确。相比之下，间接测序为 了区别在PCR反应过程中由DNA聚合酶引入的随机错朽核苷酸所引起的原始基因组序列 中的突变，以及由体外重组而产生的人工扩增产物，如产生镶嵌等位基因(混合克隆) 等，每个样品不得不测定几个PCR产物克隆的序列。
不需借助在细菌中克隆就可直接获得清蜥和准确的序列结果，其难易程度取决 于:1)只扩增靶序列的PCR引物的扩增能力(通常称为PCR特异性);2用以获笪测序模板 的方法。与引物物异性及模板制备有关的问题将在下面谈到。虽然DNA测序的化学法 (Maxam-Gilbrt)可以用来直接测序，但我们这里仅讨论Sanger的末端终止法。
最佳的PCR条件
PCR反应的特异性在很大程度上是由寡聚核苷酸引物的序列所决定的。对于特定 的引物组，PCR的特异性可以由于采用最佳的反应条件、退火温度和PCR缓冲液中的 MgCl2浓度而发生明显的变化。如果用标准的1.5mM的MgCl2浓度不能得到所需的特异 性PCR产物，我们建议MgCl2的终浓度为1.4∽2.5mM之间，以0.2mM增长率来改变MgCl2 浓度，以选择最佳Mg++浓度。一个较常遇见的问题是，使PCR特异性达到最高的MgCl2 浓度导致PCR扩增失败(dropouts)。这可能是由于模板DNA溶液中有较高的EDTA，它隆 低了提供给Taq DNA聚合酶MgCl2量。因此，对于扩增溶解在TE(1mM EDTA)中的DNA， 我们建议用含2.0mM的MgCl2的PCR缓冲液。 PCR反应的温度范围包含有三个不同的恒定期:变性期、退火期和延伸期，还有它 们之间的过渡期。为了获得用于序列分析的模板或杂交探针的单链DNA，通常并不需 要改变参数。
凝胶纯化PCR扩增的靶序列
如果最佳PCR反应条件不能产生所需的特异性产物，可采用新的寡核苷酸重新进 行扩增，或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物，而后再各自重新扩增进行序列分析。 长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离:
1.片段大小在80-100bp时，可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来 分离。 2.从胶上切下含所南非PCR片段的薄片。
3.加入50∽100μlTE浸泡胶片，可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出 来。
4.取少量(1-5%)进行第二次扩增，为得到纯净单一的产物，用于第二次PCR扩增 的凝胶抽提物的量必须少于1ng。
5.现已发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物质。因而，如需重新扩增供Tab聚合 酶测序用的片段，最好用丙烯酰胺电泳分离。
当用PCR引物扩增几个同样长度的相关序列时，如来自几个新近复制的基因，或 重复序列或保守的信号序列(conserved signal sequences)的同样显子，可以通过下 列两种不同方法来改进电泳分离。1).先用只切割某一模板的内切酶进行酶切，而后 电泳纯化完整的PCR产物。2).用可使核苷酸序列不同的扩增产物分开的电泳系统。下 一个部份将讨论此类系统中的变性甲酰胺梯度凝胶系统。采用方法一时，必须事先了 解在不同PCR产物中的内切酶位点。
杂合体的直接测序
当两个等位基因由于单一位点突变而产生差异时，用一个PCR引物直接进行测 序，能找出杂合位点。但是，带有几个点突变或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一来直接测序，将产生复合序列带(compound sequencing ladders)。有四种 方法可以确定几种点突在型并从杂合体中获得单个等位基因的序列:1).克隆分离不同 的模板;2).在测序之前，利用模板之间核苷酸序列的差异，用电泳技术分离不同的模 板;3).在测序反应中只启动一个等位基因;4).只扩增一个等位基因。 测序模板的制备
与PCR产物的直接测序有关的一些问题是变性后由于扩增片段的两条链可以迅速 结合起来，从而精品文档
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阻止了测序引物与它的互补序列退火，或阻止了引物──模板复合物 的延伸。在测序反应中，模板链重新结合使一小部份模析骖与测序从而弱化最终的测 序条带。为减少此问题，可用改进的标准双链DNA测序法或用PCR制备单链模板。 双链DNA模板
有两种不同方法用来制备测序用的模板，目前都已用来测定共价闭环双链质粒模 板的序列。用这些方法来进行PCR产物的测序通常是较困骓的，因为短的线性模板比 团环质粒的双链更易于重新结合。在这两种方法中，PCR片段可以由凝胶电胶或在电 泳前先进行旋转透析(Spin-dialysis)纯化。 1.在室温下，模板先在0.2M NaOH中变性5分钟，冰冻，加入0.4倍的5M醋酸铵 (pH7.5)来中和反应。立即用四体积的无水乙醇沉淀DNA。在合适的退火温度下，加入 测序缓冲引物。
2.在95℃下保温5分钟来变性模板，冰浴(或在干冰乙醇中)快速冷却离心管，以 减少链的重新结合。加入测序引物并使反应达到合适的温度。测序引物在变性前或后 加入都合适。 单链DNA模板
使用单链模板可以避免测序中链的重新结合。单链模板可以从双链DNA模板经链 分离凝胶中制备，或用PCR反应制备。大于500bp的单链DNA片段，可从琼脂糖凝胶中 分离笪到，但它不适合于更短的单链。制备单链DNA的另一种不同方法是在PCR反应中 使用一个生物素标记的引物，变性后的PCR产物经过一个亲合素柱而使两条链得到分 离，只有生物素标记的链才可结合到柱上。然而，最简单的方法是用改进的PCR方 法，用此方法制备既定的单链DNA。在这个反应中(不对称PCR，asymmetric PCR)，在 开始的20-25个循环中，两个比率不对称的扩增引物产生出双链DNA，当限量的那个引 物耗光后，随后的5-10个循环就产生出ssDNA。单链DNA在约在25个循环后开始出现， 这时限量的引物也几乎耗尽。经过一个短暂快速上升后，ssDNA就开始如预期的那样 呈线性积累，这时反应中仅有一个引物存在。各种比率的引物都以这种形式产生 ssDNA。一般对100μlPCR反应体系而言，引物比率为50pmo:0.5pmol，经过30个循环 后，大约可产生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的产量可用下列几种方法来估计:a)。在PCR 反应中，除了加入正常数量的dDNA外，还加入32P-dNTP。取10%的反应产物在薄的3% NuSieve+1%普通琼脂糖凝胶中电泳，干燥并与胶片一起曝光。b).取5%的反应物来走 胶，转移到膜上，并用与ssDNA互补的寡核苷酸为探针杂交。ssDNA不能用EB染色来定 量，因为ssDNA有形成二级结构的趋势且染料的插入在模板中是随机的。使用不对称 引物比例的扩增效率比两种引物均过量80-90%)的扩增效率低(70%)。在实验中，这可 通过增加PCR循环的次数来弥补。若不对称的PCR反应不能产生足够数量的ssDNA，可 以试一试不同的引物比率;b).再加5-10个PCR循环;c).在最后五个循环中多加Tab聚合 酶(2U);d).试一下相反的不对称引物比率。有时，相反的不对称引物比率可能给出不 同产量的ssDNA。制备出的单链DNA用限量的那个PCR引物或用一个内引物来测序，并 应用常规方法进行掺入测序(incorporation sequencing)或标记引物测序。制备出的 ssDNA链可能有一个不连续的5'-末端，但可能在靠近3'-末端不同位点处被切去，这 是由于延伸过程中终止过早所产生的。然而，对于测序反应中所使用的任何一种引 物，只有完整的ssDNA可以用作测序模板。 最近还报道了另一种方法制备单链核酸模板进行直接测序。这种方法包括在一个 PCR引物上加入噬菌体的启动子，转录出该PCR产物的RNA拷贝，再用反转录酶不测 序。但由于扩增反应后附加了一个酶促反应步骤和限于用反转录酶作为测序酶，这种 方法的应用受到很大的限制。
用不耐热DNA聚合酶进行PCR产物的测序
一些不耐热DNA聚合酶已经用来直接测序体外扩增的DNA。使用Klenow聚合酶，修 饰T7DNA聚合酶(测序酶)及反转录酶来测序。 用Taq聚合酶进行PCR产物的测序 Tab聚合酶除了用作PCR扩增外，它还是DNA测序的理想的酶。Tab聚合酶具有高度 的延伸能力(processivity)，较高的掺入速率，并可用一些核酶类似物如7-Deaza-2' -脱氧鸟苷-5'-三磷酸来解决DNA测序中的压缩问题。除了这些与T7DNA聚合酶相同的 性质外，它有较高的热稳定性，使反应温度可达55-70℃，这可使大量的二级结构解 体。可是，对于dNTPs而言，它有一个相对高的Km值(≈10-20μM)并缺乏3'-外切酶活 性。当dNTP浓度低于1μM时，它将产生错配和不正确的终止。琼脂和琼脂糖中都有 Tab聚合酶的抑制物，但这些可通过增加测序反应中Tab聚合酶的量(2U-10U)得到部分 解决。当精品文档
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测定克隆插入子的PCR产物序列时时，由噬菌体液裂解制备的靶基因中并不 含有从平板溶解出来的抑制物。
对带有强二级结构的DNA进行测序
带有强二级结构的DNA测序可能产生两个问题:1).由于Tab聚合酶不能完全延伸的 模板频率很高，因而降低了PCR的效率，2.).在测序反应中，压缩被测DNA序列的长 度。
研究结果表明:在PCR中使用Tab聚合酶(50-70℃)的高反应温度足够解决大部份短 的二级结构。但强的二级结构会产生强烈的抑制作用。这些只能通过加入与dGTP比例 事适的碱基类似物c7dGTP后，才可解决。同样的碱基类似物也可用在测序反应中，来 解决压缩问题(compression problem)。Tab聚合酶可以有效地掺入c7dGTP，但不能用 次黄嘌吟核苷作为碱基类似物。同样的碱基类似物也可用在测序反应中，来解决压缩 问题（COMPRESSION）。Tab聚合酶可以有效地掺入c7dGTP，但不能用次黄嘌呤核苷作 为碱基类似物。
PCR扩增DNA测序中涉及到的错误
在原始靶基因序列和由它扩增出的PCR产物之间可能有两种不一致情况:1).由点 突变引起的差异;2).由体外重组的等位基因引起的差异。点突变引起的差异是由于 每”个循环中每个核苷酸大约有2×10-4几率发生错误掺入。经过30个循环扩增后，每 个PCR产物平均在每400-4000个碱基对内存有差异。这个错误掺入的几率有时比 Klenow聚合酶(8×10-5)更高。体外重组产生的等位基因(shuffle clone)j是镶嵌PCR 产物，这可能是在以后的循环中由部分延伸的PCR产物造成的，因为它可作为另一个 等位基因模板的引物。由于酶量不足以用来延伸所有的模板，使得在以后的反应循环 中主要积累这些等位基因。除非杂合体中的两个等位基因在其PCR引物上有几个不同 位点的差异，这些人工产物进不能检测出来的。
当用PCR产物来克隆、测序并从一组相同克隆子序列(consensus sequence)推断 出各个等位基因的序列时，就必须考虑到这两种不同类型的错误。相比之下，当PCR 产物用来直接测序时，由错误掺入或镶嵌而产生的错误PCR产物并不影响PCR测序。在 各个PCR产物中由点突变引起的差异与相同序列比是检测不出的。既使这个突变(如错 误掺入)在以一个DNA分子为模板的如单个精子DNA扩增反应的第一个循环中产生，它 也仅占该位点正常核苷酸的25%。对起始DNA模板不止一个的扩增反应，在任一位点上 含有一个错配核苷酸的PCR产物的频率低到检测不出的程度。虽然目前并不很了解镶 嵌基因形成的条件，但相信这些等位基因是在反应最后几个循环中积累起来的，因为 这时酶量可能不足以用来延伸所有的模板。除非序列中有非常强烈的二级结构，在某 一特定位点上使链延伸终止，结果产生一个单一的人工基因。镶嵌基因不会影响正常 序列的测定。 测序反应的自动化
DNA测序的可重复性使它适合于完全或部分自动化。已有用常规的放射性标记引 物，或荧光终止标记或测序引物进行自动化测序的一系列仪器。但是，这些仪器仅使 分析的前半部分自动化，凝胶电泳、读带和将序列输到计算机中用后半部分自动化来 补足。前半部有两个阶段:模板的制备测序模反应，可很容易地进行自动化反应。用 Tab酶进行PCR扩增和直接测序是制备测序模板和测序反应终产物的最有效方法。一旦 使用自动进样器，就可进行自动化反应，仅电泳分析由人工进行。这对许多一直使用 人工电泳测序反应的实验室来说，都将从中受益。
第三节：PCR产物克隆方法 平端连接
通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能 在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5—10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19 的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG筛选，常可得到足量重组 子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法 克隆PCR产物。 精品文档
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粘端连接
引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非 互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切 位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互 补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计 不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长 PCR引物，除限制酶识别序列外，还需要在其5'端多合成3—4个碱基 以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此，其酶切 效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变 PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至 数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3'末端序 列的互补性是PCR成功的关键，在PCR引物的中部或近5'端改变1个或 几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的 长度，而且酶切效果优于5'加端法。对于特定DNA片段的克隆，此方 法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆，似乎5'加端法 更为适宜。
T4DNA聚合回切产生粘端
如PCR两引物的5'末端是A或T，则可在 其5'端分别加上CG和CCGG。用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP 存在的情况下，用T4DNA聚合酶进行处理，则T4DNA聚合酶因具有3'→ 5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，产生AccI和XmaI粘性末端（图1）。 此DNA片段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需 在PCR引物的5'端加2—4个碱基，但其可选择的限制酶类有限。
T－vector法
TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱 基，所加碱基几乎全是腺苷。据此，Marchuk等人采用3'端突出一个 胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物，其克隆效率比平端的连接至少高出 100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP 存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3'末端各加一处胸 苷。因为在4种dNTP都存在时，Taq聚合酶选择性参入dATP，而当仅 一种dNTP存在时，它只能参入该种碱基。因此，在只加入ddTTP时， 用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3'末端突出一个胸苷的T尾 载体，称为T－vector。用这种T－vectorsk可以较有效地直接克隆 PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备T－vector的方法。他们 使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3'末端加上一个 胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基（ddTTP）作为底物，使平 端载体DNA分子的两个3'末端各加上一个T。用这种方法制备的T－vector 的不同之处在于前者3'末端不能与待克隆PCR产物的5'末端连接，仅 5'末端可与PCR产物的3'末端形成磷酸二脂键。 共环消解法：最近，Jung等人报道了一种有效的PCR产物克隆方 法。用磷酸化的PCR引物扩增得到的PCR产物，先用T4DNA连接酶催化 连接反应，使5'端带有限制酶切位点的扩增DNA片段连接成共环结 构。然后再用相应的限制酶进行消化，产生粘端DNA片段。对于对称 性限制酶位点，只需在引蛾的5'末端加上一关识别序列，因为在串 接成共环后能恢复限制酶切位点难于切开的缺点，且可用于双限制 酶切位点的设计，只不过有PCR产物共环化后，仅约1/4的限制酶切 点得以恢复。故此法较适用于单限制酶位点的克隆。
无连接酶亚克隆法(A)
无连接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5’ 末端附加碱基修饰法，修饰碱基不是酶切位点，而是与某一质粒两 端分别互补的碱基。两引物的3’端约20—25个核苷酸分别与待扩增 DNA两翼互补，5’端各有约24个核苷酸分别与线性化质粒的3’端相 同的附加序列。由于线性化质粒的3’端序列各不相同，PCR片段可 以通过选择各引物的合适5’附加序列与引物3’端定向杂交。 由此物a和b产生的两端有附加序列的PCR产物与未反应引物分离后， 分别加入两只含有线性化质粒的反应管中进行第二次PCR。第1管中 用引物a和c，引物a即为第一PCR扩增的上游引物a，引物c为下游引 物，与紧邻5’端附加序列内测的质粒（+）链互补。同样，第2管的 引物为b和d，引物b与第一次PCR扩增的下游引物b相同，引物d为上 游引物，与紧邻5’附加序列内侧的质粒（-）链互补。
第二次PCR的第一循环中，PCR产物与质粒均变性与复性。除自身复 性产物（这种复性产物不被扩增）外，PCR产物与质粒可通过各自3’ 端互补序列杂交成部分异源双链，延伸时，重叠的3’端互为精品文档
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此物沿 各自互补链延伸，结果可产生PCR片段与线性质粒的“连接”。然后 两管中PCR扩增各进行15—20个循环。这便可产生大量一端管1）或 另一端连接有PCR插入片段的质粒。
第二次PCR后，将第1管与第2管反应液混合，用碱变性双链，中和后 稀释变性的DNA。反应管中的单链DNA可以复性或几种不同的产物， 除各自本身复性产物外，管1产物ssDNA与管2中ssDNA可形成部分异 源双链DNA，并各自有一较长的5’或3’悬端，这种长的5’或3’悬 端相互互补，在低DNA浓度时可复性产生环化DNA。
尽管这种环化的DNA有两个缺口，但它们可以直接用来转化受体大肠 直杆菌。一旦进入体内，两个缺口便共价连接，修复的质粒即可复 制，下面以从λ噬菌体DNA中扩增-500bp片段，并克隆入pGem4Z载体 中为例说明LFS法。
这种方法同样适于复杂基因组中基因片段的克隆。需注意的是第一 次PCR时两引物的5’附加序列不应太短以免影响第二次PCR时异源双 链的形成，以24个核苷酸较为合适。扩增时若形成，引物二聚体， 一定要去除，否则会严重影响转化率。用LFS法已成功地克隆了长达 1.7kb的基因片段。这种方法的优点是：①可用于常规方法无法进行 亚克隆的片段；②适于任何PCR产物和任何质粒；③可亚克隆特殊目 的（如含点突变、缺失或插入等）片段；④在某些情况下，对已构 建了启动子或增强子等序列的载体，可使待表达片段插入定向合适 位置；⑤较快，可在1d内完成，较常规方法可靠，不需DNA连接酶。
DNA克隆是分子生物学的重要内容。特定基因的克隆常因两端缺乏合 适限制酶切点而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、筛选因难。采 用PCR技术行DNA和cDNA的克隆，则可大大缩短克隆时间，比之全基 因合成更为经济和方便，因而愈来愈受重视。用PCR方法进行传染性 疾病和遗传性疾病的诊断常遇到产物的异性问题和分型问题，采用 产物克隆和测序方法，比之寡核苷酸探针杂交方法更为准确。随着 PCR技术的不断发展和推广，新的PCR产物的克隆方法也将不断出现。
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