快速敏捷检测人乳头瘤病毒基因型的实时荧光PCR方法

内蒙古大学学报(自然科学版)JournalofInnerMongoliaUniversity2008Nov..39VolNo.6

　　文章编号:1000-1638(2008)06-0667-05

快速敏捷检测人乳头瘤病毒基因型的

实时荧光PCR方法

X

于光婕1,郑琳琳1,玮　娜1,王　猛1,齐红岩2,王迎春1

(1.内蒙古大学生命科学学院,呼和浩特010021;2.内蒙古医学院附属医院妇产科,呼和浩特010050)

摘要:宫颈癌是女性最常见的一种恶性肿瘤,研究表明人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的

发生密切相关.采用实时荧光PCR技术对引起宫颈癌的两种主要HPV亚型

HPV16和18

型阳性质粒进行检测,在实验室中成功构建了HPV16和18型的检测体系以及体外模拟的双重感染检测体系,并对三例临床确诊为宫颈癌的标本进行实时荧光PCR验证检测,确定三例标本均为高浓度HPV16型感染,极易引起宫颈癌变,与医院诊断结果相符合.本实验为实时荧光PCR技术检测HPV16和18型的临床检验在实验室中成功地进行了探索,为实时荧光PCR技术在宫颈癌大规模筛查上的应用提供了研究基础.

关键词:HPV;实时荧光PCR;宫颈癌

中图分类号:R446.8;R737.33　　文献标识码:A

引　言

　　宫颈癌是女性最常见的一种恶性肿瘤,它的发病率居女性恶性肿瘤第二位,全世界每年的新发病例约50万,其中20万死于宫颈癌.研究表明人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的发生密切相关,全世界范围内,HPV16和18型感染在宫颈癌中最为普遍,统计发现大约75%～80%的癌细胞中存在

〔1,2〕

HPV16和18型.宫颈癌的发病在全世界范围有一定的地区分布,发展中国家高于发达国家,我国

3,4〕

目前每年仍有10万多宫颈癌新发病例(约占世界的1/4),两万多人死于宫颈癌〔.在发达国家,其发

生率明显下降,在很大程度上归因于对宫颈癌前病变的早期诊断和治疗,而由于宫颈筛查工作不完善以及女性对宫颈疾病的忽视,致使我国宫颈癌的发生率是发达国家的6倍.因此,迫切需要发展一种快速、高灵敏度的检测手段来广泛开展宫颈癌大规模筛查工作以降低我国宫颈癌发病率.

目前,我国大部分地区进行宫颈癌筛查的主要方法为传统宫颈刮片巴氏涂片法及液基细胞学检查(TCT)等.而实时荧光PCR技术是近年来在普通PCR技术的基础上发展出的一项新的核酸检测技术,因其具有检测灵敏度高、特异性强等优点可满足宫颈癌大规模筛查的需要,目前实时荧光PCR技

6〕术已被报道应用于遗传性疾病的诊断、病原体的检测和肿瘤分子诊断等方面〔.罗小琼等对TCT及

〔5〕

使用实时荧光PCR进行高危型HPVDNA检测这两种检查手段进行比较,发现实时荧光PCR法检测HPVDNA总检出率显著高于TCT(P<0.01),可对细胞学正常或轻度异常患者的未来发展进行预

7〕

警,在宫颈癌筛查中较TCT而言更具优越性〔.因此,我们利用HPV阳性质粒针对宫颈癌中感染最为普遍的HPV16和18型构建了实时荧光PCR检测体系,并用临床标本对体系进行验证,为今后利用实时荧光PCR技术进行宫颈癌大规模筛查进行前期探索.

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收稿日期:2008-07-25;修回日期:2008-09-24

基金项目:内蒙古大学2007年本科生创新培养基金(序号:74)和国家基础科学人才培养基金(J07308)资助

项目

作者简介:于光婕(1986～),女(达斡尔族),内蒙古呼和浩特市人,2005级生物技术基地本科生.通讯作者:王迎春(1966～),女,内蒙古呼和浩特市人,教授.E-mail:ycwang@imu.edu.cn668

内蒙古大学学报(自然科学版)2008年

1　材料和方法

1.1　标本来源

标本包括宫颈癌手术切除标本三例,以及作为阴性对照的正常妇女宫颈脱落细胞标本若干例,均由合作研究人齐红岩提供.1.2　试剂和仪器

TaqDNA聚合酶、dNTP等试剂为宝生物(TaKaRa)公司产品.所用仪器为ABI公司生产的7300实时荧光定量PCR仪.1.3　引物和探针序列

选择编码HPV晚期蛋白的L1区中的通用引物GP5+/6+进行PCR扩增反应.引物序列GP5+为5′-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3′,GP6+为5′-GAAAAATAAACTGTAAATCATA-,引物采用HPV通用引物委托上海生工合成.TTC-3′

在通用引物GP5+/6+扩增的片段内设计HPV16和18型的特异性探针,HPV16型探针为FAM-5′-TCATTATGTGCTGCCATAT-3′-BHQ,HPV18型探针为HEX-5′-CTTCTACACAGTCTCC-TGTA-3′-BHQ,探针为自主设计委托上海生工合成并修饰.1.4　DNA模板的提取

1.4.1　宫颈癌手术切除标本的基因组DNA提取　取适量组织在液氮中研磨,然后加入细胞裂解液进行细胞裂解,并加入蛋白酶K及RNase进行消化,然后依次用苯酚及酚-氯仿-异戊醇进行抽提,用乙醇清洗沉淀后用TE回溶.

1.4.2　宫颈脱落细胞标本的基因组DNA提取　将宫颈刮板上的脱落细胞洗脱在细胞保存液中,重悬细胞后取适量细胞悬液按照宫颈癌手术切除标本的基因组DNA提取方法进行提取.

1.5　HPV16和18型阳性质粒的构建

采用片段重叠延伸法在实验室中分别构建了HPV16和18型阳性质粒.根据NCBI所公布的HPV16和18型的DNA序列,分别各人工合成两条约80bp的长片段,中间互补重叠15个碱基.首先,将2个含有重叠序列的合成片段在PCR体系中进行重叠延伸15个循环,再以延伸产物作为模板,以上下游引物(GP5+/6+)做第二轮PCR,在高保真Taq酶作用下扩增HPVDNA.然后将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳,检测片段大小.确定为目的片段后切胶回收产物,与pMD-19T载体连接后转化大肠杆菌DH5A感受态细胞中,分别得到HPV16和18型阳性质粒.

1.6　实时荧光PCR检测

使用ABI7300实时荧光定量PCR仪进行扩增检测反应.25LL反应体系中包括0.4Lmol/L引物GP5+,0.4Lmol/L引物GP6+,2.5UTaq酶,0.6Lmol/LTaqman探针,50Lmol/LdNTP,以及2.5LL10×buffer(含Mg)和5LLDNA模板或阳性质粒,以蒸馏水作空白对照.扩增条件为:95℃预变性3min后,95℃变性20s,45℃退火45s,72℃延伸30s,共40个循环,循环结束后延伸10min,在退火阶段采集荧光信号.

分别对HPV16和18型阳性质粒进行实时荧光PCR检测后,将两种质粒混合在一起作为模板在体外模拟双重感染,使用HPV16和18型两种探针进行检测.成功建立检测体系之后用同样方法对三例宫颈癌手术切除标本及正常人的宫颈脱落细胞标本进行实时荧光PCR检测.

2+

2　结　果

2.1　基因组DNA电泳结果

从图1可以看出所提取的基因组DNA具有清晰的条带,样品2的DNA有少量降解但是实时荧光PCR结果显示并不影响结果的判断.

第6期

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2.4　宫颈癌手术切除标本的验证

对三例临床确诊为宫颈癌的手术切除标本进行实时荧光PCR验证检测,确定这三例标本均为高浓度HPV16型感染,极易引起宫颈癌变,这与医院诊断结果相符合.

3　讨　论

　　实时荧光PCR技术是在普通PCR技术的基础上发展出的一项新的核酸检测技术,该方法通过计算机控制可实现对PCR扩增产物进行实时动态检测和结果自动分析,无需对PCR反应产物进行后处理,节省了检测时间;同时实时荧光PCR均在单管封闭条件下进行,极大地避免了PCR产物对待检样品的污染,减少了假阳性;且检测的灵敏度高,特异性强,重复性好,即可定性又可定量,是适合于临床

8,9,10〕

常规检测的分子生物学实验手段〔.

在实验中使用HPV16和18型的阳性质粒作为模板进行实时荧光PCR扩增可以得到十分标准的2n扩增曲线,随着循环数的增加荧光值不断升高,判断结果十分简便.其中HPV18型的荧光值略低,分析原因可能是由于探针标记的荧光基团所致,HEX标记探针的荧光值比FAM标记探针的荧光值略低.当使用该体系对宫颈癌手术切除标本进行检测时,可以发现所得到的扩增曲线Ct值相对较大,这是由于宫颈癌手术切除标本提取的基因组DNA浓度低于阳性质粒模板,但并不影响结果的判断.实验中的三例宫颈癌手术切除标本经过实时荧光PCR检测确定均为HPV16型感染,该结果也可以证实在宫颈癌变组织中最主要感染的是HPV16型.由于标本数量较少,没有检测到另一主要致病型HPV18型的感染.另外对若干例宫颈脱落细胞标本也进行了检测,所扩增出的曲线与空白一致即均未有HPV感染.

　　多重感染在宫颈癌病例中是十分常见的情况,HPV的多重感染或称重叠感染,是指在某一个体或某一种病变中感染或检测到两种或两种以上的HPV亚型

〔11,12〕

.资料表明两种HPV亚型或两种以

〔13〕

上HPV亚型的多重HPV感染者波动于2%～71%之间,其中报道最多集中在10%～20%等2003年研究发现美国正常女性中44.7%有HPV多重感染感染中占有极大比例,在多重感染中也极为常见

〔15〕

〔14〕

.Peyton

.陶萍萍等实验中发现多重感染的比

例为44.6%,并且最常见二重感染类型为HPV52、58,其次为HPV16、18,这说明HPV16不光在单型

.由于双重感染最为普遍,故将HPV16和18型质

粒混合作为反应模板在体外模拟HPV16和18型双重感染的情况,建立双重感染检测体系,实时荧光PCR结果显示HPV16和18型感染均可成功被检测.但没有发现所检测的阳性标本中有HPV16和18

型的双重感染,这与标本数量较少有一定关系.

此外,多重PCR反应体系组分较为复杂,需要对其进行优化以得到更加准确可靠的结果,这里我们优化了Taq酶、dNTP、探针、模板等因素并最终确定适宜浓度.其中模板浓度要求较低,这说明所建立的HPV检测体系的灵敏度高,可以对微量模板成功进行检测;同时发现探针浓度并不是影响结果的主要因素,单管中使用0.6Lmol/L的探针就可以对标本进行准确分型鉴定,可以大大降低检测成本,有利于这项技术在临床上的大规模推广和利用.

综上所述,应用实时荧光PCR技术构建的HPV16和18型检测体系成功通过验证,证实了实时荧光PCR技术具有特异性强、灵敏度高、费用低等一系列适合宫颈癌大规模筛查的优点,并为实时荧光PCR技术在宫颈癌大规模筛查方面的应用提供一些研究基础.

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RapidandSensitiveDetection

ofHumanPapillomavirusGenotypesbyReal-timePCR

111121

YUGuang-jie,ZHENGLin-lin,WEINa,WANGMeng,QIHong-yan,WANGYing-chun

(1.CollegeofLifeSciences,InnerMongoliaUniversity,Hohhot010021,China;

2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,

AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalCollege,Hohhot010050,China)

　　Abstract:Cervicalcarcinomaisoneofthemostcommoncancersinwomen,mostofcervicalcarcinomaiscausedbyHPV(HumanPapillomavirus).HPV16andHPV18aretwomainhighrisksubtypescausingcervicalcarcinoma.HPV16andHPV18DNAfragmentsaredetectedbythereal-timePCRwiththesuccessfulsub-typingdetectionsystemdesignedwithpositiveplasmids.Anotherdual-infectiondetectionsystemisdesignedforsub-typingindual-infection.Thesystemisconfirmedbythreetissuesamplesfromoperations.ThemethodofdetectionHPVbyreal-timePCRisprovedtobeeffectiveinpractice,arapid,sensitiveandvaluableassaytodetectHPV16andHPV18infectionswithcervicalcells,canbeappliedforlarge-scalescreeningandclinicaldiagnosis.

Keywords:HPV;real-timePCR;cervicalcarcinoma