一、菌落介绍：
菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细胞集合而成。当样品稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数：
在一定条件下（需养、营养条件、PH、培养温度和时间等）每克或毫升检样所生长出来的细菌菌落总数。需氧、37度、48H
二、检验方法
菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中取出1ml置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度条件下，培养48小时后，记录每个平皿中形成的菌种数量，依据稀释倍数，计算出每克或毫升原始样品中所含杨的细菌菌落总数。
基本操作步骤：样品的稀释》倾注平皿》培养48h》计数报告
三、具体步骤
（一）样品的处理和稀释
1、操作方法：以无菌操作取检样25g或ml，放于225ml灭菌生理盐水或被其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振要或研磨制成1:10的均匀
稀释液。（固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均匀器中以8000—10000r/min的速度处理1min。）
用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
甲溶液浓度为0.1。 我们取甲溶液1毫升，再加9毫升蒸馏水，制得乙溶液（浓度变为0.01）。
再取乙溶液1毫升，加蒸馏水9毫升，制得丙溶液（浓度变为0.001）
再取丙溶液1毫升，加蒸馏水9毫升，制得丁溶液（浓度变为0.001）
再取丙溶液1毫升，加蒸馏水9毫升，制得丁溶液（浓度变为0.001）
依次类推，可得到0.0001、0.00001、0.000001。。。。。。这样的溶液。这个过程就是十倍递增稀释。
另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。
2、无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。
操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分
钟，每个平板不得超过15个菌落。
3、采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
4、样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。
在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。
为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。
5、稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。
（二）倾注培养
1、操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。
待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，
乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。
2、倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。
倾注培养基的量规定不一，从12-20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。
3、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。。
4、培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。
（三）计数和报告
1、操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。
2、到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。
3、计数时应选取菌落数在30-300之间的平板（SN标准要求为25-250个菌落），若有二个稀释度均在30-300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。
4、若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。
5、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。
6、当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。
如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。
7、当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。
8、菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1-100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。
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