实验七 食用菌母种的扩大培养

实验七 食用菌母种的扩大培养

一、实验目的

深入理解食用菌母种的含义、重要性和生产上的作用。学会常用母种培养基的配制方法，掌握母种转管继代培养技术，了解食用菌母种制作的工艺流程和制作母种的基本技能。

二、实验原理

食用菌母种是指从大自然首次分离得到的纯菌丝体，多通过孢子分离法、组织分离法和菇木分离法获得纯菌丝体。因其在试管里培养而成，并且是菌种生产的第一步骤，因此又被称为试管种或一级种。纯菌丝体在试管斜面上再次扩大繁殖后，则形成再生母种。它既可以繁殖原种，又适于菌种保藏。母种的扩大培养是从一支母种转接、培养、扩繁成若干支母种的过程，整个过程期间，须在无菌环境条件下，进行母种菌的转接、培养与扩繁。

三、实验所需

1. 菌种：平菇、杏鲍菇、金针菇、灰树花等。

2. 材料试剂：马铃薯、葡萄糖、琼脂、酵母膏、75%酒精等。

3. 仪器用具：天平、电炉、熬制锅、刀砧、小刀、玻棒、纱布、漏斗架、漏斗（套接橡胶管和）、止水夹、试管（18×180mm左右）、棉花、橡皮筋、牛皮纸（报纸）、棉线、铁筐、高压灭菌锅、超净工作台、酒精棉瓶、长柄镊子、接种具（钩、锄等）、酒精灯、火柴、垫架、标签、笔等。

四、实验内容

（一）母种培养基配制

（1）培养基配方

常用培养基PDA：马铃薯（去皮去芽眼）200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml、酵母膏2.5g。

（2）培养基配制

将马铃薯去皮洗净、挖去芽眼，称取200g，用刀砧切碎，放入熬制锅（内壁有容积刻度）中，加入清水，电炉加热煮沸后调小火力，维持约20min，煮至软而不烂为止。用双层湿沙布过滤，得过滤薯液，再向过滤液中加入琼脂20g继续加热，待琼脂溶化后，添加葡萄糖20g及酵母膏2.5g，补足水分至1000ml，搅拌均匀煮沸溶化后准备装管。

（3）分装试管

培养基配制后应趁热分装。装入培养基占试管的1/4~2/5处，装管时控制好止水夹头，对培养基流向、流速、流量进行控制，勿使管内外壁沾上培养液，以免浸湿棉塞，易受杂菌污染。装管后塞上预先做好的棉塞。棉塞大小、松紧度应适宜，以用手提棉塞而试管不脱落为准。然后用橡皮筋将每7~10支试管扎成一捆，捆头棉塞上方用报纸包好，纸外系紧棉线，避免灭菌时被灭菌锅腔内水蒸汽浸湿。

（4）灭菌（卧式高压蒸汽灭菌锅）

灭菌前将水加至规定水位标记区段。将盛放试管的铁筐放入锅内，关上灭菌室门，选择灭菌条件（0.14Mpa，123℃），启动仪器开始工作，灭菌锅内蒸汽不断升温升压，当灭菌室气温、气压均达到所需灭菌条件时，开始计时，维持30min。灭菌结束后，打开排气阀排气，待压力表指针自然回至“0”位时，排出锅内剩余蒸汽后，打开灭菌室门。注意切忌在压力表未回到“0”位时就放汽，以免试管内的培养基向上冲，浸湿棉塞，造成以后菌种的污染。

（5）摆斜面

将从灭菌锅中取出的试管，趁热倾斜桌面躺放于特制的木条上，使管内液态培养基随着试管的斜躺而向管口端流淌，形成培养基的斜面，其长度占试管长度的1/2~3/5为宜，自然冷却后即成斜面培养基，制得接种所需的待接管。

（二）接种

（1）紫外线杀菌

接种前，把待接管、接种工具、酒精棉瓶、镊子、酒精灯、火柴、标签纸等所要用到的所有用具、物件均放入超净工作台工作仓内，打开紫外灯照射30分钟以上。

（2）接种操作

准备接种时，关闭紫外灯，放入母种管。用75%酒精对双手、镊子、接种工具、母种管、待接管、工作台面等进行仔细擦拭、全面消毒。点燃酒精灯，用其火焰灼烧接种工具，进一步灭菌后，左手持管，母种管居上，待接管居下，呈水平状，培养基斜面自然向下，

待接种工具灼烧冷却后，悬空伸入母种管，先去除管口先端培养基菌块（可能老化）约1cm，随即依次向管尾端切取一小块母种菌块（带培养基），迅速将切取小菌块转入待接管斜面培养基的中间位置，立即过火塞好棉塞，整个转接过程必须在酒精灯火焰8~10cm空间范围内进行操作，严防感染杂菌，接种完成后贴好标签（菌种、接种人、接种时间）。

（三）菌丝培养

接种后将转接管置于25℃恒温箱中培养，2~3天后可见接种的小菌块周围发生白色绒毛状菌丝，此时每天要检查杂菌污染情况，及时去除受杂菌感染的试管，培养约10~15天后，菌丝可长满斜面。

五、实验数据

（可计算接种成功率=未受杂菌感染的试管数/总的转接试管数×100%）

六、实验总结