食品中幽门螺杆菌荧光PCR快速检测

）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔＭｅｄｉｃｉｎｅＥｄｉｔｉｏｎ　　　　ｙ（

Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．１　

Ｊａｎ．２０１１

１７５

）文章编号］６７１５８７２０１１０１０１７５０４　　［　１－Ⅹ（－－食品中幽门螺杆菌荧光ＰＣＲ快速检测方法的建立及评价

刘静秋１，史艳宇１，刘金华２，邴　炜１，华　蕾１，杨　波１，朱　颖１，王洪昌１

（）吉林省产品质量监督检验院，吉林长春１吉林出入境检验检疫局，吉林长春１１．３００２２；２．３００６２

［摘　要］　目的：建立一种快速、特异、灵敏的幽门螺杆菌检测方法，并对方法进行评价，为快速、准确、有效检测幽门螺杆菌方法的建立提供依据。方法：以尿素酶基因序列为靶位点，用ＰｒｉｍｅｒＥｘｒｅｓｓ３．０软件设计引　　ｐ物及探针，经Ｂｌａｓｔ软件对相似序列搜索后，筛选出一套最优与常见致病菌无交叉反应的引物；分别用食品中常见致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门菌和空肠弯曲菌ＤＮＡ进行特异性实验；将计数过的幽门螺杆菌菌悬液与牛奶样品混合液，梯度稀释后分别提取ＤＮＡ进行荧光ＰＣＲ扩增，确定检测方法的灵敏度；对人工污染幽门螺杆菌的生奶及生肉样品进行检测验证方法的可行性。结果：利用尿素酶基因设计的引物及探针仅对幽门螺杆菌有扩增曲线，而其他对照以及阴性对照均未有明显扩增曲线；能够对生奶及生肉中污染的幽门螺杆菌进行有效扩增；设计的引物对幽门螺杆菌的检测敏感性可达到３ＣＦＵ·ｍＬ－１，检测可以在４ｄ内完成。结论：荧光ＰＣＲ方法特异性强，灵敏度高，可以快速、准确检测食品中污染的幽门螺杆菌。［关键词］ＣＲ；食品　幽门螺杆菌；尿素酶基因；荧光Ｐ［中图分类号］文献标志码］３７７；Ｑ５０３　　［　Ｒ　Ａ

ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ　　　　　　　　　

ｌｏｒｉＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｎｆｏｏｄ　　　ｐｙ１１２１１１

，Ｓ，Ｌ，Ｂ，ｉｕｕＬＩＵＪｉｎＨＩＹａｎＩＵＪｉｎｈｕａＩＮＧ　ＷｅｉＬｅｉＢｏ　－　－　－　，ＨＵＡ　　，ＹＡＮＧ　ｑｙｇ

１１

ＺＨＵ　ＹｉｎＨｏｎｃｈａｎ－ｇ，ＷＡＮＧ　ｇｇ

（，Ｃ；１．ＪｉｌｉｎＰｒｏｄｕｃｔＱｕａｌｉｔＳｕｅｒｖｉｓｉｏｎＩｎｓｅｃｔｉｏｎｈａｎｃｈｕｎ１３００２２，Ｃｈｉｎａ　　　　ｙｐｐｇ　，Ｃ）２．ＪｉｌｉｎＥｎｔｒｘｉｔＩｎｓｅｃｔｉｏｎａｎｄＱｕａｒａｎｔＢｕｒｅａｕｈａｎｃｈｕｎ１３００６２，Ｃｈｉｎａ　－Ｅ　　　　　ｙｐｇ

：Ｏ，ｓＡｂｓｔｒａｃｔｂｅｃｔｉｖｅｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｒａｉｄｅｃｉｆｉｃａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉ，　Ｔ　　　　　　　　　　　　ｐｐｐｙｊｒｏｖｉｄｅａｉｒｒｉｍｅｒｓｒｏｂｅａｎｄａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｎｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｏｆａｎｄ　　　　　　Ｈ　　　　　　ｐｐｐｐｇｐｙ　，ｓｃｏｒｒｅｓｏｎｄｉｎｅｎｅｔｏｔｈｅｕｒｅａｓｅｆｏｒｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｗｅｒｅｄｅｓｉｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｔｏＰｒｉｍｅｒＥｘｒｅｓｓ３．０ｓｏｆｔｗａｒｅｉｍｉｌａｒ　　　　　　　　　　　　　ｐｇｇｇｇｐ　　，ａｗｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｄｂＢｌａｓｔｍｅｔｈｏｄｎｄｔｈｅｅｘｃｅｌｌｅｎｔｒｉｍｅｒｓａｎｄｒｏｂｅｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ．ＤＮＡｆｒｏｍｃｏｍｍｏｎｓｅｕｅｎｃｅｓ　　　　　　　　　　　　　ｙｐｐｑ　，Ｌｂａｃｔｅｒｉａｌａｔｈｏｅｎｓｓｕｃｈａｓｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｓｔａｈｌｏｃｏｃｃｕｓｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｔｏｅｎｅｓ，Ｃａｍｌｏｂａｃｔｅｒａｎｄ　　　　Ｅ　　ｐｇｐｙｙｇｐｙ；ｔＳａｌｍｏｎｅｌｌａｉｎｆｏｏｄｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｓｅｃｉｆｉｃｔｅｓｔｈｅｃｏｕｎｔｅｄＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉｉｎｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｕｓｅｎｓｉｏｎａｎｄｔｈｅ　　　　　　　　　　　　　　ｐｐｐｙ，ｔ，ｔｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｄｍｉｌｋｍｉｘｔｕｒｅｗｅｒｅｓｅｒｉａｌｌｄｉｌｕｔｅｄｈｅＤＮＡ　ｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｏｒｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｈｅ　　　　　　　　　　　　ｙｐ　ｏｆｍｅｔｈｏｄｗａｓｔｅｓｔｅｄ．Ｔｈｅｒａｃｔｉｃａｂｉｌｉｔｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈｒｏｕｈｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔ　　　　　　　　　　　　　ｐｙｇｙ　　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｖｅｓａｍｌｅｓｂｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓｈｅｒｉｍｅｒｓａｎｄｒｏｂｅａｃｃｏｒｄｉｎｔｏｕｒｅａｓｅｅｎｅｃｏｕｌｄ　　　　　　Ｔ　　　　　　　ｐｙｐｐｇｇ　　ｏｎｌａｍｌｉｆＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒＤＮＡ，ｂｕｔｎｏｔｏｔｈｅｒｒｅｆｅｒｅｎｃｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＤＮＡ．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｆｒｏｍｔｈｅｌｏｒｉｌｏｒｉ　　　　　　　　　ｙｐｙｐｙｐｙ　　

ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｖｅｓａｍｌｅｓｃｏｕｌｄｂｅａｍｌｉｆｉｅｄｂｔｈｅｍｅｔｈｏｄ．Ｉｔｃａｎｄｅｔｅｃｔ３ＣＦＵ·ｍＬ－１ｏｆＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　　　　　　　　　　　ｐｐｙ　　

ｌｏｒｉ．Ｉｔｓｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｗａｓｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｔｏｄｅｔｅｃｔ３ＣＦＵ·ｍＬ－１ｏｆＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｎｏｕｈｒａｉｄ　　　　　　　　　　　ｙｇｐｐｙｐｙ　

ｔｏｆｉｎｉｓｈｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎ４ｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｃａｎｒａｉｄｌａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｌｄｅｔｅｃｔｔｈｅＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉ　　　　　　　　　　　　ｐｙｙｐｙ　　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｆｏｏｄｗｉｔｈｈｉｈｓｅｃｉｆｉｃｉｔａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔ．　　　　　　ｇｐｙｙ　［收稿日期］　２０１００６２３－－［）基金项目］　国家质量监督检验检疫总局资助课题（２００８ＱＫ５９

［，女，吉林省长春市人，高级工程师，主要从事食品生物技术方面的研究。作者简介］　刘静秋（１９６２－）［：０，Ｅ－ｍ：ｓ通信作者］　史艳宇（Ｔｅｌ４３１８５２３７２４３ａｉｌｈｉａｎｕ２１９＠１６３．ｃｏｍ）－ｙｙ

１７６

吉林大学学报（医学版）７卷　第１期　２０１１年１月　第３

：Ｈ；ｅｎｅＫｅｗｏｒｄｓｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉ；ｕｒｅａｓｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ；ｆｏｏｄ　　　　ｇｐｙｙ　

Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉ，Ｈ　　幽门螺杆菌（　ｐ）是一ｐｙ种弯曲、螺旋状革兰阴性杆菌。流行病学调查证实：罹患胃病的人群中有超过５０％的人感染幽门螺杆菌。幽门螺杆菌感染与慢性萎缩性胃炎、十二指肠溃疡、胃黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤和胃腺癌的发生有关联，ＷＨＯ已经将幽门螺杆菌列为第

［］

１类致癌因子１－２。由于幽门螺杆菌与人类常见病有密切关联且在人群中感染率高，因而受到重视。

化恒温培养箱购自德国宾得公司；微量移液器（０．１～１０００．０μＬ）为法国ＪＩＬＳＯＮ产品；恒温水　

浴锅购自北京中西远大科技有限公司；厌氧罐购自日本三洋公司。

１．４　幽门螺杆菌的稀释与计数　取幽门螺杆菌冻干粉接种于ＢＨＩＢ增菌肉汤，加入５％无菌小牛血，在清，于微需氧条件下３７℃振荡培养３ｄ６００ｎｍ波长下测定培养液吸光度。当吸光度达到１．０时，取１ｍＬ菌液涂胰蛋白大豆琼脂平板进行

，另取１ｍ浓度单位为Ｃ计数（ＦＵ·ｍＬ－１）Ｌ菌液用作模板ＤＮＡ的提取。

１．５　ＤＮＡ的提取　取幽门螺杆菌培养物，按细菌基因组小量提取试剂盒说明书的方法进行ＤＮＡ提取，相关步骤略作修改：延长裂解酶作用时间至。用Ｄ２０ｍｉｎＮＡ分析仪检测其纯度及浓度。１．６　幽门螺杆菌引物设计　根据幽门螺杆菌尿素酶基因在ＧｅｎＢａｎｋ中检索到１个基因序列

（。根据基因序列用ＰａｃｃｅｓｓｉｏｎＭ６０３９８）ｒｉｍｅｒ　３．０设计探针及引物。在ＧｅｎＢａｎｋＥｘｒｅｓｓ　ｐ（／／ｈｔｔｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｏｖＢＬＡＳＴ）中经ｐ：／ｇＢｌａｓｔ软件对相似序列搜索后，筛选出一套最优的且与常见致病菌无交叉反应的引物。Ｆｏｒｗｏｒｄ：ｒｉｍｅｒｐＲｅｖｅｒｓｅ　

，５′ＣＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＴＣＣＡＴ３′－－：５′ＧＧＴＡＴＧＣＡＣＧＧＴｒｉｍｅｒ－Ｇ－ｐ

近年来大量研究证明：食品污染在人类幽门螺杆菌感染中起重要作用，是幽门螺杆菌传播的途径之

］３６－。目前我国幽门螺杆菌临床检测方法相对较一［

多，但有关食品中幽门螺杆菌的检验及鉴定方法研

７］

，因此究较少，相关检验方法标准处于空白水平［

研究食品中幽门螺杆菌的快速、简便、准确的检测鉴定方法尤其必要。本研究以尿素酶基因序列为靶位点设计引物及探针，进行荧光ＰＣＲ扩增，建立幽门螺杆菌荧光ＰＣＲ检测方法，对幽门螺杆菌进行准确、特异、高灵敏度检测。１　材料与方法

ｌｏｒｉ，１．１　菌　株　幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙ，大肠杆菌（ＡＴＣＣ４３５０４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，　　，金黄色葡萄球菌（ＡＴＣＣ２５９２２）Ｓｔａｈｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙ，单增李斯特菌（ａｕｒｅｕｓ，ＡＴＣＣ１３５６５）Ｌｉｓｔｅｒｉａ　，沙门菌ＣＣ５３１３）ｍｏｎｏｃｔｏｅｎｅｓ，ＡＴ　１ｙｇ（，空肠弯Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｈｉｍｕｒｉｕｍ，ＡＳ１．１１９４）　ｙｐ）。曲菌（ＣａｍｌｏｂａｃｔｅｒＪｅｕｎｉ，ＡＴＣＣ３３２９１　　ｐｙｊ１．２ｘＰｒｅＴＭ　ＤＮＡ提取试剂　试剂及培养基　Ａｙｐ盒购自Ａｘｅｎ公司，ＴａＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲ　　ｙｇｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ试剂盒购自美国ＡＢＩ公司，引物及探　

针由宝生物工程有限公司（大连）合成。脑心浸液肉汤（购自青岛高科园海博生物技术有限公司，ＢＨＩＢ）根据产品说明书配制；胰蛋白大豆琼脂购自美国，Ｄ；无菌小牛血清ＢｅｃｔｏｎｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍａｎ　　ｐｙ购自新西兰Ｉ集团）有限公司；无ＣＰｂｉｏ生物技术（菌脱纤维马血购自烟台开发区品格林实验室配套设备有限公司。

１．３　主要仪器　高速冷冻离心机购自美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司；ＩＫＡ　Ｍ２０食物研磨器购自德国ＩＫＡＬａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｓｔａｕｆｅｎ公司；ＡＢＩＰＲＩＳＭ　　

／ＣＲ扩增仪购自美国ＡＢＩ公司；ＤＮＡ７５００荧光ＰＲＮＡ蛋白分析仪购自日本ＢｉｏＳｅｃｍｉｎｉ公司；生　ｐ

，Ｐ：５ＴＡＣＧＡＧＴＴＴ３′ｒｏｂｅ′ＦＡＭ－ＡＡＧＴＧＧＧ－－－。ＴＡＴＴＧＡＡＧＣＧＡＴＧＴＴＴＣＣＴＧＡ－ＴＡＭＲＡ３′－：共２１．７　反应体系和反应条件　反应体系（５μＬ）

２×ＴａＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲ　ＭａｓｔｅｒＭｉｘ１２．５μＬ，　　　　ｑ１０μｍｏｌ引物各１μＬ，模板ＤＮＡ２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　７．５μＬ。反应条件：９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变，６，４性１５ｓ０℃退火延伸４０ｓ０个循环。１．８　特异性和灵敏度实验　分别用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门菌和空肠弯曲菌食品中常见致病菌进行特异性实验。取１ｍＬ已计数过的幽门螺杆菌菌悬液，梯度稀释后分别提取ＤＮＡ进行荧光ＰＣＲ检测，确定检测方法的灵敏度。

１．９　荧光ＰＣＲ方法检测实际食品样品　取鲜牛奶、生肉（制成匀浆）等样品９ｍＬ与３ｍＬ幽门螺杆菌菌悬液充分混匀，离心，取沉淀提取ＤＮＡ，进行荧光ＰＣＲ检测。

刘静秋，等．ＣＲ快速检测方法的建立及评价　食品中幽门螺杆菌荧光Ｐ

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１．１０　荧光ＰＣＲ方法测定牛奶中幽门螺杆菌的灵敏度　取１ｍＬ计数过的幽门螺杆菌菌悬液与９ｍＬ牛奶样品混合均匀，用牛奶分别进行１０倍梯度稀释。分别提取ＤＮＡ，按上述反应条件进行荧光

ＰＣＲ扩增，检测食品基质对检测方法灵敏度的影响。２　结　果

２．１　尿素酶基因特异性验证　在优化好的荧光ＰＣＲ反应体系和反应条件下，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门菌和空肠弯曲菌ＤＮＡ为特异性试验对照进行荧光ＰＣＲ检测。仅有幽门螺杆菌有扩增曲线，而其他对照以及阴性对照均未有明显扩增曲线。引物特异性实验结果见图１。

图２　荧光ＰＣＲ敏感性检测结果Ｆｉ．２　ＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ　　　　ｇｙ　

２１　　

１：３×１０ＣＦＵ·ｍＬ－１；２：３×１０ＣＦＵ·ｍＬ－１；３：３×０１０ＣＦＵ·ｍＬ－１；４：０．３ＣＦＵ·ｍＬ－１；５：Ｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．　ｇ

图３　人工污染样品中的幽门螺杆菌ＰＣＲ检测

Ｆｉ．３　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｖｅｓａｍｌｅｓｂ　　　　　　ｇｐｙｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ　　

图１　引物特异性试验

Ｆｉ．１　Ｓｅｃｉｆｉｃｉｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｉｍｅｒｓ　　　ｇｐｙｐ　

；；１：Ｎｅａｔｉｖｅｏｎｔｒｏｌ２：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉｒｏｍｏｗｍｉｌｋ３：　ｃ　　ｆ　ｃｇｐｙｌｏｒｉＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎ．　　　ｐｙ２．２　灵敏度实验　分别取各浓度幽门螺杆菌菌悬

液，提取ＤＮＡ进行荧光ＰＣＲ检测，利用尿素基因设计的引物对幽门螺杆菌的检测敏感性可达到３ＣＦＵ·ｍＬ－１。荧光ＰＣＲ结果见图２。２．３　尿素酶基因检测人工污染样品中的幽门螺杆菌　应用尿素酶基因的特异引物对人工污染的生奶及生肉进行荧光ＰＣＲ检测，试样中幽门螺杆菌均有明显扩增曲线。检测结果见图３。

２．４　荧光ＰＣＲ方法测定牛奶中幽门螺杆菌的灵敏度　取１ｍＬ计数过的幽门螺杆菌菌悬液与牛奶混合，梯度稀释后分别提取ＤＮＡ进行荧光ＰＣＲ检测，牛奶中幽门螺杆菌的检测敏感性可达到３ＣＦＵ·ｍＬ－１。结果见图４。

图４　牛奶基质条件下荧光ＰＣＲ敏感性检测结果Ｆｉ．４　ＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｌｋｃｏｎｔａｉｎｅｄＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　　　　ｇｙ　

ｌｏｒｉｂｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ　　　ｙｐｙ　

３２　　

１：３×１０ＣＦＵ·ｍＬ－１；２：３×１０ＣＦＵ·ｍＬ－１；３：３×１０　１０ＣＦＵ·ｍＬ－１；４：３×１０ＣＦＵ·ｍＬ－１；５：０．３ＣＦＵ·ｍＬ－１．

３　讨　论

幽门螺杆菌感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃癌的发生也有密切的关系。幽门螺杆

１７８

吉林大学学报（医学版）７卷　第１期　２０１１年１月　第３

］，２（）：２Ｊ．ＥｉｄｅｍｉｏｌＲｅｖ０００，２２２８３２９７．ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ［　－ｐ［］Ｖ’：，２ｅｌａｚｕｅｚＭ，ＦｅｉｒｔＪＭ．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　　ｑｇｐｙ　

，ｄａｔｈｏｅｎｉｃｉｔｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｍｏｄｅｏｆｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　　　　　ｐｇｙ］，１ｉｍｌｉｃａｔｉｎｆｏｏｄｓａｎｄｗａｔｅｒ［Ｊ．ＩｎｔＪＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ９９９，　　　　　ｐｇ　（／）：９５３２３５１０４．－［］Ｇ３ｏｍｅｓＢＣ，ＤｅＭａｒｔｉｎｉｓＥＣＰ．ＴｈｅｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｏｆＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　　　　　　ｇ

，ｆｌｏｒｉｉｎｗａｔｅｒｏｏｄａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓａｍｌｅｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　　　　　ｐｙｐ，２（）：３００４，１５３９７４０３．Ｃｏｎｔｒｏｌ－［］窦逾常，王江滨．胰腺癌患者幽门螺杆菌感染的检测及临床意４

］（）：３义［Ｊ．吉林大学学报：医学版，２００８，３４２１７３１９．－［５］ＦａｎＸＧ，ＣｈｕａＡ，ＬｉＴＧ，ｅｔａｌ．ＳｕｒｖｉｖａｌｏｆＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　　　　　　

，ｌｏｒｉｉｎｍｉｌｋａｎｄｔａｗａｔｅｒ［Ｊ］．ＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌＨｅａｔｏｌ　　　　　　ｐｙｐｐ　）：１１９９８，１３（１１０９６１０９８．－［］Ｑ６ｕａｌｉａＮＣ，Ｄａｍｂｒｏｓｉｏｏｒｍａｎｎｏｔｌ．Ｈｉｈ　　Ａ，Ｎ　Ｇ，ｅ　ａｇｇ

，ｓｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉｉｎｒａｗｏａｔｈｅｅａｎｄｃｏｗ　　　　　　　ｐｙｇｐ　：ＡｍｉｌｋｎｆｅｒｒｅｄｉｓｋｆｏｏｄｂｏｒｎｅｌｍＭｅｎｅ　ｉ　ｂ　ｇ　ｒ　ｏ　ｆ－ｙ　ｇ？［］，２（）：４ｉｎｆｅｃｔｉｏｎＪ．ＩｎｔＪＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ００８，１２４１３４７．　　　－［］Ｌ７ｏｔｔｓｅｉｃｈＣ，ＳｃｈｗａｒｚｅｒＡ，ＰａｎｔｈｅｌＫ，ｅｔａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆ　　　　　ｐ

ｔｈｅｌｏｒｉｎｏｖｅｌＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒＣｌａｒｉｒｅｓｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲａｓｓａｆｏｒ　　　　　－　　ｐｙｙ　ａｎｄｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｃｉｎｓｕｓｃｅｔｉｂｉｌｉｔｔｅｓｔｉｎｏｆＨ．ｌｏｒｉｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　　　ｙｐｙｇｐｙ　　ｉｎｓｔｏｏｌｓｅｃｉｍｅｎｓｆｒｏｍｓｍｔｏｍａｔｉｃｃｈｉｌｄｒｅｎ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎ　　　　　　ｐｙｐ，２（）：１００７，４５６７１８１７２２．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ－［］Ｇ８ｕｉｌｌｅｒｍｏＩＰ，ＲｏｔｈｅｎｂａｃｈｅｒＤ，ＢｒｅｎｎｅｒＨ．Ｅｉｄｅｍｉｏｌｏｏｆ　　　ｐｇｙ　

］，２）：ｌｏｒｉＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ００４，９（２　　ｐｙ１６．－［］Ｓ９ｔｅｖｅｎｓｏｎＴＨ，ＬｕｃｉａｃｕｆｆＲ，ｅｔｌ．Ｇｒｏｗｆ　　ＬＭ，Ａ　Ｇ　ａ　ｏ

Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉｉｎｖａｒｉｏｕｓｌｉｕｉｄａｎｄｌａｔｉｎｍｅｄｉａ［Ｊ］．　　　　　　ｐｙｑｐｇ　，２（）：９ＬｅｔｔＡｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ０００，３０３２１９６．　　－ｐｐ

［］ｌｏｒｉ１０ＰｏｍｓＲＥ，ＴａｔｉｎｉＳＲ．ＳｕｒｖｉｖａｌｏｆＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｎｒｅａｄ　　　　　　　－ｐｙｙ

］，２：ｔｏｅａｔｆｏｏｄｓａｔ４℃［Ｊ．ＩｎｔＪＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ００１，６３（３）－　　　　　　２８１２８６．－［，Ｔ１１］ＣｈｉｓｈｏｌｍＳＡ，ＯｗｅｎＲＪｅａｒｅＬＥ，ｅｔａｌ．ＰＣＲｂａｓｅｄ　　　　　

ｄｉａｎｏｓｉｓｆｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎｎｄｅａｌｔｉｍｅ　ｏ　Ｈ　ｐ　ｉ　ａ　ｒ－ｇｙｏｆｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｄｉｒｅｃｔｌｆｒｏｍｈｕｍａｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　　　　　ｙｙ　］，２：ａｓｔｒｉｃｂｉｏｓｓａｍｌｅｓ［Ｊ．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ００１，３９（４）　　　ｇｐｙｐ　１２１７１２２０．－［］］李会强．幽门螺旋杆菌实验室诊断方法［１２Ｊ．中国慢性病预防

（）：１与控制，２００７，１５２８７１９０．－［］倪红霞，刘志辉，郑学星，等．Ｔ１３ａＭａｎ探针荧光定量ＰＣＲｑ

］支原体快速检测方法的建立及应用［Ｊ．吉林大学学报：医学（）：７版，２０１０，３６４９７８０２．－菌本身的螺形、鞭毛结构及其分泌的细菌毒素、空泡毒素、尿素酶、黏蛋白酶、过氧化氢酶、磷脂酶、热休克蛋白及低分子趋化性蛋白质黏附素等都与其致病性有关

［］２４－。

幽门螺杆菌感染呈全球性分布，但不同国家和地区或不同人群的感染率差异较大。感染率与当地公共卫生状况有关。发达国家感染率为２０％～

［，］４０％，中国人群的感染率为２１％～９３％５７。近年来研究表明：大量生制的奶（羊奶、牛奶）及生奶制

品中含有一定数量的幽门螺杆菌，在水、莴苣、豆腐和鸡肉等食品中也常含有幽门螺杆菌。食品中幽门螺杆菌的存在成为人类患病的又一重要原因，对

］３５－。人类健康有严重的危胁［

幽门螺杆菌对体外生长条件要求苛刻，培养困难，传统培养方式对于快速准确进行检测与鉴定有一定难度

［］２，９１０－。因此如何快速检验这些食品中的

幽门螺杆菌、保证食品安全是一个重要课题。除传统培养方法外，现在国内外其他检测幽门螺杆菌的方法主要有直接镜检法、染色法、尿素酶法、免疫、基因学法、核酸杂交技术、聚合酶链反应（ＰＣＲ）

］１１１３－。这些方法在临床样蕊片、毛细管电泳技术等［

品检测方面应用较多，但在检测食品中幽门螺杆菌方面应用较少，目前国内尚无食品中幽门螺杆菌快速有效检测方法及相关标准。

本研究根据尿素酶基因设计特异性引物及探针，成功建立了食品中幽门螺杆菌的荧光ＰＣＲ检测方法，填补了食品中幽门螺杆菌检测方法及标准的空白。与以往相关研究方法比较，本研究方法具、特异有快速、灵敏（灵敏度可达３ＣＦＵ·ｍＬ－１）的特点。本研究中所采用方法可应用于临床诊断、食品卫生监督及出口食品的病原微生物检测等各个领域，可以为食品中新的致病菌的检测提供技术支持，同时为食品安全风险预警提供依据。

［参考文献］

［：Ｅｌｏｒｉ１］ＢｒｏｗｎＬＭ．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｄｅｍｉｏｌｏａｎｄｒｏｕｔｅｓｏｆ　　　　ｐｙｐｇｙ