蚌埠医学院学报２０１１年９月第３６卷第９期 ９３５ ［文章编号］１０００－２２００（２０１１）０９－０９３５－０３ ・基础医学・ 间日疟原虫ＭＳＰ１—１９基因的克隆与表达 李光友 ，陈勇 ，夏惠 ，方强 ，刘丹 ，买月琴 ，贺文欣 ［摘要］目的：构建间日疟原虫ＭＳＰ１．１９（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－１—１９，Ｐｖ ＭＳＰ１—１９）基因克隆及表达的载体。 方法：将ＭＳＰ１．１９基因克隆入原核表达载体ｐＥＴ２８ａ中，构建重组表达载体。以重组载体转化大肠埃希菌ＢＬ２１，在ＩＰＴＧ诱导 下表达重组Ｐｖ ＭＳＰ１—１９蛋白。采用亲合层析纯化重组蛋白，应用ＳＤＳ—ＰＡＧ电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ对表达产物进行鉴定和分析。 结果：成功构建了质粒ｐＥＴ２８ａ／Ｐｖ ＭＳＰ１—１９，并在大肠埃希菌中诱导可溶性表达的目的蛋白。表达的蛋白能与间日疟患者血 清发生特异性结合反应。结论：成功地原核表达出Ｐｖ ＭＳＰ１—１９目的蛋白，为问日疟的疫苗研制提供了实验基础。 ［关键词］问日疟；ＭＳＰ１—１９基因；原核表达；基因表达 ［中国图书资料分类法分类号］Ｒ ５３１．３１ ［文献标识码】Ａ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－－１－－１９ ｇｅｎｅ ＬＩ Ｇｕａｎｇ—ｙｏｕ ，ＣＨＥＮ Ｙｏｎｇ ，ＸＩＡ Ｈｕｉ ，ＦＡＮＧ Ｑｉａｎｇ２，ＬＩＵ Ｄａｎ ，ＭＡＩ Ｙｕｅ—ｑｉｎ ，ＨＥ Ｗｅｎ．ｘｉｎ （ ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２．Ｄｅｐａｒｔｅｍｎｔ ｆｏＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｇｂｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｎｇｂｕ Ａｎｈｕｉ ２３３０３０，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｖｅｃｔｏｒ ｗｈｉｃｈ ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｓａｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ ＭＳＰ１－１９ Ｇｅｎｅ（Ｐｖ ＭＳＰ１—１９）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ Ｐｖ ＭＳＰ１—１９ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ２８ａ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ．ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｖ ＭＳＰ１—１９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｕｎｄｅｒ ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｂｙ ａｆｉｆｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ｈＴｅ ＭＳＰ１—１９ ｇｅｎｅ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ２８ａ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ａｓ ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅａｃｔｅｄ ｓｐｅｃｉｉｆｃａｌｌｙ ｗｉｔｌｌ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｅｒｕｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ Ｐｖ ＭＳＰ１— １９ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ，ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｐｌｓａｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ；ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ一１—１９；ｇｅｎｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 疟疾是严重危害人类健康的寄生虫病，其中间 有效防治疟疾疫苗受到越来越多研究者的重视。由 ３１疟是流行最广泛的疟疾之一，危害性仅次于恶性 于在问日疟生活史中，唯有红内期原虫能使人体致 疟…。我国中部沿黄淮流域地区疫情回升势头虽 病甚至危及生命，所以研制针对红内期的疫苗对降 得以遏制，但疟疾发病仍处较高水平 ，因此研制 低问日疟的发病率和病死率具有重要意义。疟原虫 裂殖子主要蛋白１（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ一１， ＭＳＰ１）是一种表达于裂殖子表面的蛋白，由于其位 ［收稿日期］２０１０—１２４）１ ［基金项目］卫生部寄生虫病预防与控制技术重点实验室开放课题 于裂殖子表面，所以认为它可能参与裂殖子的入侵， 资助项目（ＷＫ００８４）４） 是重要疫苗候选分子之一＿３ Ｊ。它含有保护性免疫 ［作者单位］蚌埠医学院１．免疫学教研室，２．病原生物学教研室，安 功能域，可以产生特异性保护性抗体，这些抗体可以 徽蚌埠２３３０３０ ［作者简介］李光友（１９８２一），男，硕士研究生． 阻止疟原虫入侵红细胞。本研究以间日疟原虫 ［通讯作者］夏 惠，硕士研究生导师，教授．Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉａｈｕｉ９１２＠ ＭＳＰ１羧基端１９ ｋＤａ片段（Ｐｖ ＭＳＰ１—１９）进行克隆与 ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ． 表达，以期获得ＭＳＰ１—１９重组蛋白，制备抗原和为 ｌＪｉ Ｘ．Ｌｉ Ｃ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ４ ｉｎｄｕｃｅｓ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ［６］ 吴胤瑛，李恩孝．ＶＥＧＦ在恶性肿瘤中的研究进展［Ｊ］．现代肿 ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｇｌｉｏｍａ Ｕ８７ＭＧ［Ｊ］．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，７６（４）： 瘤医学，２００５，１３（５）：１８—２０． ｌ８１—１９２． ［７］ Ｇａｒｋａｖｔｓｅｖ Ｉ，Ｋｏｚｉｎ ＳＶ，Ｃｈｅｒｎｏｖａ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｔｕｍｏｕｒ Ｃｏｌｌａ Ｓ，Ｔａｇｌｉａｆｅｒｒｉ Ｓ，Ｍｏｒａｎｄｉ Ｆ，ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ ｎｅｗ ｔｕｍｏｒ—ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＮＧ４ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｕｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ４ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４２８（５）：３２８—３３２． ｏｆ ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｎｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ［８］ Ｘｉｅ ＹＦ，ｚｈａｎｇ ＨＦ，Ｓｈｅｎｇ ＷＨ，ｅｔ ａｌ，Ａｄｅｎｏｖｉｍｓ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ＩＮＧ４ ｈｙｐｏｘｉａ—ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ－１ Ｍｐｈａ ａｃｔｉｖｉｔｙ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ— ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｖｉａ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４４６４—４４７５． ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ 王金志，缪竞诚，盛伟华，等．ＩＮＧ４基因真核表达载体的构建 ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００８，２７１（１）：１０５—１ １６． 及其功能［Ｊ］．解剖学杂志，２００５，２８（４）：３８３—３８６． （本文编辑马启） ９３６ 问日疟疫苗的研制提供基础。 １材料与方法 １．１材料ＩＰＴＧ、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、Ｔａｑ多聚酶和ＰＣＰ 试剂均为宝生物公司（大连）产品。蛋白Ｍａｒｋｅｒ购 自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司。质粒小提试剂盒和凝胶回收试 剂盒为天根生化科技有限公司产品，引物由上海生 工生物工程技术服务有限公司合成。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ２１、 ＤＨ５ａ及ｐＥＴ一２８ａ均为本实验室保存。ＮＣ膜购自 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司。Ｎｉ离子亲和柱购白ＧＥ公司。羊抗 人ＩｇＧ—ＨＲＰ购于Ｓｉｇｍａ公司，ＤＡＢ底物显色系统购 于武汉博士德公司。问日疟患者血清及压积血为本 实验室保存。其余试剂均为国产分析纯。 １．２ 方法 １．２．１ ＭＳＰ１ １９基因扩增根据Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ问１３ 疟ＭＳＰＩ．１９基因序列设计引物。卜＾游引物Ｐ１：５ 一 ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＡＴＧ ＴＧＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＡＧＴ ＴＡＴ ＴＡＡ Ｃ一３ ；下游引物Ｐ２：５ 一ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＣＴ ＡＣＡ ＧＡＡ ＡＡＣ一３ 。以问日疟患者压积血获取 ＤＮＡ为模板，以Ｐ１和Ｐ２为引物，扩增ＭＳＰ１—１９基 因片段。扩增参数：９５℃５ ｍｉｎ；９５℃３０ Ｓ，５６ ３０ Ｓ，７２℃２ ｍｉｎ，共３２个循环；再于７２ 延伸 ７ ｍｉｎ。取ＰＣＲ扩增产物４ ｌ进行琼脂糖凝胶电泳 鉴定。按照天根生化科技有限公司ＤＮＡ回收试剂 盒说明书进行操作，自凝胶中回收ＭＳＰ１—１９片段。 １．２．２ ＭＳＰ１—１９重组表达载体构建及鉴定ＢａｍＨ Ｉ和Ｘｈｏ ｌ双酶切ｐＥＴ２８ａ载体和ＰＣＲ扩增片段， Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接两个片段并转化ＤＨ５ａ感受态 细胞，涂ＬＢ琼脂平板并挑单菌落进行ＰＣＲ扩增和 双酶切鉴定，阳性克隆经测序验证后保持菌种。 １．２．３ ＭＳＰＩ一１９重组蛋白的诱导表达将重组表 达质粒ｐＥＴ２８ａ／ＭＳＰ１—１９转化大肠埃希菌表达宿主 ＢＬ２１后，挑取阳性克隆于含１０ ｍｇ／Ｌ卡那霉素的 ＬＢ培养基中，３７ ｃＩ＝过夜培养，次日按１：１００稀释扩 种，至Ａ６００约为０．６时，在菌液中加入ＩＶＦＧ至终 浓度为０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ，在３０℃诱导表达６ ｈ。分别于 诱导后１、２、３、４、５和６ ｈ各取样１ ｍｌ收集并裂解菌 体，加入１×ＳＤＳ样品缓冲液进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳分 析表达货白。 １．２．４表达产物的纯化离心收集菌体，用１／１０ 培养基体积的贮存液（５０ ｍｍｏ￣Ｉ Ｔｒｉｓ—Ｈｃｌ，ｐＨ ８．０， ２ ｍｍｏＶＬ ＥＤＴＡ）重悬，加入溶菌酶至终浓度 １００ ｇ／ｍｌ，再加１／１０体积１％的Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００， Ｊ Ｂｅｎｇｂｕ Ｍｅｄ Ｃｏｌｌ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１１，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．９ ３０℃温育３０ ｒａｉｎ，置冰浴中超声处理，超声破罅 离心，留取上清。参照Ｎｉ离子亲和层析柱说明，将 收集的上清以ｌ５～２０ ｍｌ／ｈ流速过柱，再分别Ｊ｛ｊ禽 咪唑８０、５００ ｍｍｏｌ／Ｌ溶液洗柱并收集洗脱液。 １．２．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达产物将重组蛋ｈ ＭＳＰＩ一１９样品经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分离后，再电转移 硝 酸纤维素膜上。以５０ ｇ／Ｌ脱脂奶粉封闭２ ｈ，依次 与１：１００稀释的问日疟患者血清（室温２ ｈ、ＰＢＳ洗 ３次）以及１：１ ０００稀释的羊抗人ＩｇＧ—ＨＲＰ（窄湍反 应１ ｈ、ＰＢＳ洗涤３次）进行反应，最后加底物ＤＡＢ 显色并拍照。 ２ 结果 ２．１ ＭＳＰ１—１９基因扩增ＰＣＲ扩增状得约 ４００ ｂｐ条带，同预计的ＭＳＰＩ １９毖因片段的大小牛Ｉ｛ 符（见图１）。 ２．２ ＭＳＰＩ一１９重组表达载体的鉴定 ＭＳＰ１—１９ ＰＣＲ产物与ｐＥＴ一２８ａ载体分别经ＢａｍＨ Ｉ币１Ｉ Ｘｈｏ Ｊ 双酶切后连接，转化ＤＨ５ｏ￣。挑选 落进仃舣牌 切鉴定，得到约为４００ ｂｐ酶切产物（ 网２） ． ２．３ ＭＳＰＩ １９的诱导及表达在蛋门Ｍａｒｋｅｒ约为 １９ ０００处出现１条新生的蛋白带（见 ３），¨颅期 的ＭＳＰＩ一１９蛋白相符合。 ２．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析ＭＳＰＩ一１９表达将纯化 的 重组蛋白进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析显尔，在 … 条带 上出现一条与羊抗人ＩｇＧ—ＨＲＰ血清起反 的条带 （见图４）。 ３讨论 问日疟原虫寄生于人体红细胞内，典裂殖了川 期性大量增殖导致红细胞破裂，引起机体发病。 此，只要能够抑制裂殖子入侵红细胞，就町以钉效的 降低疟疾的临床发病。ＤＮＡ疫苗能够较为全面的 诱导体液和细胞免疫应答，儿具有操作简 和造价 低廉等特点 。研制ＤＮＡ重组疫苗 成为抗 疾疫苗的重要途径之一。 ＭＳＰＩ足疟原虫在裂体增殖的过 ｆｌ合成的， 是一种被覆于裂殖子表面的糖蛋白 『ＨＪ…ｌ 原虫的 ＭＳＰ１基因没有内含子，编码１ ７２６个氨基酸，十｝】埘 分子质量约２００ ０００，ＭＳＰＩ在裂体增殖的后期，分 为小的蛋白多肽片段¨ “ ，其巾相ｘ，Ｉ－￣Ｙ子质 为 １９ ０００的羧基端片段，被携带进入红细胞１人Ｊ。研 究 表明，在猴和鼠疟疾模型中，１）），ＭＳＰ１—１９和 蚌埠医学院学报２０１１年９月第 鲞箜 ｌ ２ １ ｂｐ ２ ９３７ ｂｐ ｋＤａ １Ｏ０ ｌ ２ ３ ２ ０００ ２ ０００ ６０ ｌ ０００ ７５０ ５００ ４０ １ ０００ ７５０ ５００ ２５０ １００ ２５０ ２５ １００ ｌ７ １：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；２：ＭＳＰＩ一１９基因ＰＣＲ产物 １：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；２： Ｉ和ＸｈｏＩＸ２酶产物 １：Ｍａｒｋｅｒ；２：正常对照；３：间日疟 图４ ＭＳＰ１—１９表达的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析 图１ ＭＳＰ１—１９基因ＰＣＲ扩增产物的琼脂糖 凝胶电泳鉴定 ８ ７ ６ ５ ４ ３ 图２重组载体ｐＥＴ一２８ａ—ＭＳＰ１—１９的酶切鉴定 ２ １ ｋＤａ ９７ ６６ ４３ ３１ ｍａｌａｉｒａ ｅｎｄｅｍｉｃ ａｒｅａ ｏｆ ａｆｉｒｃａ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，１７３（１）： ６６６—６７２． ｇ ＲＳ，Ｌｏｎｇ ＣＡ．Ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｍｕｈｉｐｌｅｔａｒｇｅｔｓ［Ｊ］． ［４］ ＮｕｄｅｅｎｚｗｅｉＳｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６５（５１７７）：１３８１—１３８５． ［５］ Ｍａｒｃｌｅ ＵＦ，Ｗｅｂｅｒ ＬＲ，Ａｎｇｅｌａ ＰＴ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ２Ｏ ｌ４ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｌｌａｒｉａａ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｎｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ一１（ＭＳＰＩ）ｏｆ ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆｌｃｉａｐａｒｕｍ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２００３，３０ （４）：６５—７５． １：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ；２：Ｂ１２１空菌： ３～８分别为ＩＰＴＧ诱导１，２、３、４、５、６ ｈ的表达 图３ ＭＳＰ１ １９基因表达的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析 ［６］ Ｒａｉｎｃｚｕｋ Ａ，Ｓｍｏｏｋｅｒ ＰＭ，Ｋｅｄｚｉｅｒｓｋｉ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＭＳＰ４／５ ａｇａｉｎｓｔ ｌｅｔｈａｌ ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａｂａａｄｉ ａｄａｍｉ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ＭＳＰ１＿４２免疫分别诱导出对攻击感染的保护作用。 然而ＭＳＰ１．１９更加引人注目，因为其在不同疟原虫 ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００３，２１（２１）：３０３０—３０４２． ［７］ Ｚａｋｅｒｉ Ｓ，Ｄｊａｄｉｄ ＮＤ，Ｚｅｉｎａｌｉ Ｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ一１ ｇｅｎｅ（ＭＳＰ１）ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ 株中高度保守。因此ＭＳＰ１—１９抗原为疟疾防治的 重要疫苗候选分子之一。 ｗｉｌｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ ｓｏｕｔｈｅａｓｔｅｍ Ｉｒａｎ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｔｒｏｐｉｃａ，２００３，８８ （１）：９１—９７． 体外蛋白表达一般分为原核和真核两大类，真 核表达具有天然构象和活性等优点，但其表达水平 较低，培养条件严格，操作复杂，成本高，不利于大规 模生产。与其相比，原核表达量高，条件简单，成本 低¨ 。我们选用大肠埃希菌作为宿主菌，成功的表 达出可溶性的ｐＥＴ一２８ａ／ＭＳＰ１—１９重组蛋白，然后经 ［８］ Ｖａｒｇａｓ—Ｓｅｒｒａｔｏ Ｅ，Ｃｏｒｒｅｄｏｒ Ｖ，Ｇａｌｉｎｓｋｉ ＭＲ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＳＰ ａｎｄ ＭＳＰ－９ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｌｏｓｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ Ｐｌａｓｎｍｄｉｕｍ ｃｏａｔｎｅｙｉ ｔｏ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ［Ｊ］． Ｉｎｆｅｃｔ Ｇｅｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００３，３（１）：６７—７３． ［９］ Ｓｅｖｅｒｉｎｉ Ｃ，Ｍｅｎｅｇｏｎ Ｍ，Ｇｒａｄｏｎｉ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｌ￣ｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｉ离子层析柱纯化，经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳表明，ｐＥＴ一 ２８ａ／ＭＳＰ１—１９重组蛋白大小约为１９ ｋＤａ，与理论大 ［１Ｏ］ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｍａｌａｒｉａ ｃａｓｅ ｉｎ Ｉｔｌｙ［Ｊ］．Ａｃｔａａ Ｔｒｏｐｉｃａ，２００２，８４（２）：１５１—１５７． Ｄｅｌ Ｐｏｒｔｉｌｌｏ ＨＡ，Ｌｏｎｇａｃｒｅ Ｓ，Ｋｈｏｕｒｉ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ １ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ ｒｅｖｅａｌｓ 小基本相符。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ印迹分析显示，表达的重 组蛋白能够被问日疟患者血清所识别，而与正常人 血清不反应，表明所表达的重组蛋白具有一定的免 ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｅｉ，１９９１，８８（９）：４０３０—４０３４． Ｄｅｌ Ｐｏｒｔｉｌｌｏ ＨＡ，Ｇｙｓｉｎ Ｊ，Ｍａｔｔｅｉ ＤＭ，ｅｔ ａ１．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ： 疫活性，为进一步的疟原虫疫苗的研究提供必要的 基础。 ［ 参 考 文 献 ］ ［１］Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｉ，Ｇａｌｉｎｓｋｉ ＭＲ，Ｂａｉｒｄ ＪＫ，ｅｔ ａ１．Ｋｅｙ ｇａｐｓ ｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ，ａ ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｍａｌａｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｅ［Ｊ１．Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００９，９（９）：５５５—５６６． ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｊｏｒ ｂｌｏｏｄ—ｓｔａｇｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ［Ｊ］． Ｅｘｐ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，１９８８，６７（２）：３４６—３６３． ［１２］ Ｔｉａｎ ＪＨ，Ｋｕｍａｒ Ｓ，Ｋａｓｌｏｗ ＤＣ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｏｆ ｐｌａｓｍｏｄｊｕｍｙ０ｅｌｉｉ［Ｊ］． Ｉｎｆｅｃ Ｉｍｍｕｎｔ，１９９７，６５（８）：３０３２—３０３６． ［２］周水森，王漪，汤林华．２００８年全国疟疾形势［Ｊ］．中国寄生虫 学与寄生虫病学杂志，２００９，２７（６）：４５５—４５７． ［３］Ｊｏｈｎ ＣＣ，Ｏ Ｄｏｎｎｅｌｌ ＲＡ，Ｓｕｍｂａ ＰＯ，ｅｔ ａ１．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｉｎｖａｓｉｏｎ． ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｆｏｒ ｔｈｅ １９ ｋＤａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ［１３］ Ｇｏｏｄ ＭＦ，Ｋａｓｌｏｗ ＤＣ，Ｍｉｌｌｅｒ ＬＨ．Ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａ ｍａｌａｒｉａ ｂｌｏｏｄ—ｓｔａｇｅ ｖａｃｃｉｎｅ［Ｊ］．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，１６（４）：５７—８７． ａｓｌｕｎｄ Ｓ，Ｎｏｒｄｌｕｎｄ Ｐ，Ｗｅｉｇｅｈ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ［１４］ Ｇｒｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－１（ＭＳＰ１—１９）ｃａｎ ｐｌａｙ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ａｇａｉｎｓｔ ｂｌｏｏｄ—ｓｔａｇｅ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆ ａｌｃｉ ｐａｒｕｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｉｎ ａ ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，５（２）：１３５—１４６． （本文编辑章新生）