(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105906699 A(43)申请公布日 2016.08.31
(21)申请号 201610284535.5(22)申请日 2016.04.29
(71)申请人 中国医学科学院北京协和医院
地址 100010 北京市东城区王府井帅府园1
号(72)发明人 蔡炯
(74)专利代理机构 北京同辉知识产权代理事务
所(普通合伙) 11357
代理人 刘洪勋(51)Int.Cl.
C07K 14/47(2006.01)C12N 15/12(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12P 21/00(2006.01)
(54)发明名称
肺癌的抗原蛋白及其编码基因和治疗性肺癌疫苗的制备方法(57)摘要
本发明提供了一种肺癌的抗原蛋白及其编码基因和治疗性肺癌疫苗的制备方法，首先选用的MUC1多肽表位靶点，该靶点是正常细胞没有的，只有癌症细胞和癌前期细胞特异表达，具有很好的安全性。其次选择的佐剂Cs直接和MNR通过基因融合重组表达偶联，增加了MNR蛋白的免疫原性。
C07K 1/36(2006.01)C07K 1/34(2006.01)C07K 1/30(2006.01)C07K 1/22(2006.01)A61K 39/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01)
权利要求书1页 说明书8页序列表18页 附图3页
CN 105906699 ACN 105906699 A
权 利 要 求 书
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1.一种肺癌的抗原蛋白，包括如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列组成的蛋白质，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述抗原蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的抗原蛋白的编码基因，其特征在于，所述DNA分子的上游和下游还分别包括一个酶切位点，上游的酶切位点为NdeI酶切位点；下游的酶切位点为NcoI酶切位点。
4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组表达载体。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的出发载体为pMAL-p5X。
6.含有权利要求5所述的重组表达载体的重组菌或转基因细胞系。
包括：7.一种治疗性肺癌疫苗的制备方法，
(1)用加有氨苄青霉素的培养基活化带有权利要求4所述重组表达载体的DH5α菌株，然后加入IPTG诱导表达，离心收集细菌培养基；
(2)向细菌培养基加入硫酸铵水溶液沉淀后悬起进行亲和纯化和麦芽糖水溶液洗脱，得到纯化的蛋白质；
(3)对纯化的蛋白质进行超滤浓缩，得到目的蛋白质；(4)对目的蛋白质去毒处理，然后加入佐剂混合，得到治疗性肺癌疫苗。8.根据权利要求7所述的治疗性肺癌疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，硫酸铵水溶液的质量浓度为26.3％-53.0％。
9.根据权利要求7所述的治疗性肺癌疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，麦芽糖水溶液浓度为10mmol/L。
10.根据权利要求7所述的治疗性肺癌疫苗的制备方法，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝佐剂。
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说 明 书
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肺癌的抗原蛋白及其编码基因和治疗性肺癌疫苗的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种肺癌的抗原蛋白及其编码基因和治疗性肺癌疫苗的制备方法。背景技术
[0002]我国每年的新发癌症病人约有250万，因癌症而死亡的人数约为140万。未来空气、水质污染、环境破坏可能进一步提高癌症的发病率和病死率。从病种看，居全国恶性肿瘤发病第一位的是肺癌，其次为胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌，居全国死亡第一位的仍是肺癌，其次为肝癌、胃癌、食管癌和结直肠癌。
[0003]癌症治疗药物的研究是当今国际上的研究热点。癌症治疗除了手术、化疗、放疗外，生物免疫治疗近年来发展迅速，细胞治疗、抗体治疗和疫苗治疗形成三足鼎立之势，大有围癌症而歼灭之可能。疫苗治疗癌症应用方便，效果显著，深受广大患者欢迎。接种肿瘤疫苗是免疫治疗方法中的一种，其原理是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫反应，即激活患者自身的免疫系统，来增强机体的抗癌能力，进而阻止肿瘤的生长、扩散和复发，最终达到控制甚至清除肿瘤的目的。肿瘤不是外来的，而是自体细胞发生的，因此机体对它的反应不如对细菌、病毒的反应那样强烈，以致早期症状不明显，发现的时候肿瘤往往已经到了晚期阶段，肿瘤细胞发生了转移，所有的治疗方法都无法达到治愈的目的。而接种肿瘤疫苗则可以在肿瘤发生的早期就可以高效、特异地清除肿瘤，而且不良反应小。此外，肿瘤疫苗治疗也可与手术治疗、放疗及化疔相结合，在综合治疗肿瘤中占有重要地位。
[0004]肿瘤疫苗来源于自体或异体肿瘤细胞或其粗提取物，带有肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。它可通过激发特异性免疫功能来攻击肿瘤细胞，克服肿瘤产物所引起的免疫抑制状态，增强肿瘤相关抗原的免疫原性，提高自身免疫力来消灭肿瘤。肿瘤特异性抗原的免疫治疗可以启动以肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞反应为主的抗肿瘤效应，有效打击肿瘤，防止转移、复发且不伤及正常组织，其抗肿瘤特异性和免疫记忆性是其他方法所不能比拟的，具有疗效高、特异性强、不良反应小等优点。根据肿瘤疫苗的具体用途，可分为两种：一种是预防性疫苗，如用与某些特殊肿瘤发生有关的基因或抗原制备疫苗，接种于具有遗传易感性的健康人群，进而可以控制肿瘤的发生。另一种是治疗性疫苗，它以肿瘤相关抗原为基础。
[0005]免疫系统对恶性细胞的免疫监控失败时出现癌症，癌细胞局部或全身出现免疫抑制状态。细胞恶化过程中出现遗传和表观遗传的改变，合成一些突变的蛋白或改变一些基因的表达水平；癌变细胞基因组不稳，更易累积遗传改变，增加了潜在的抗原；癌细胞细胞内和微环境中的因素会促进癌细胞产生适应性反应、蛋白翻译和降解发生改变，在细胞表面出现免疫多肽组的改变，表达和正常细胞表达的质和量是不一样的肿瘤相关抗原。[0006]利用肿瘤相关抗原诱发肿瘤特异的免疫反应具有重要价值，其原理是通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。一
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种方法就是将纯化或者重组的肿瘤相关抗原和佐剂一起注射，诱发体液免疫和细胞免疫。细胞免疫在肿瘤杀伤中作用举足轻重，常用的方法是联合使用共刺激分子或免疫性化学治疗、放疗和免疫监测点阻断剂。临床试验中可采用注射一种或多种MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤相关抗原来源表位多肽，这种表位可以和抗原递呈细胞表面的MHC分子结合，直接呈递给T细胞。临床试验中可采用全长的肿瘤相关抗原、表位合成长多肽或糖化多肽模拟体。表位合成长多肽在使用上不受病人MHC限制，它被DC等抗原递呈细胞加工和呈递诱导免疫反应。糖化多肽模拟体可以用于血液病等肿瘤的治疗。多肽癌症疫苗一般加Montanide ISA-51作为佐剂，皮下或肿瘤内注射，也可以联合使用TLR激动剂Picibanil、Hiltonol，或α-干扰素、白介素-2、GM-CSF等细胞因子，或免疫刺激抗体如PD-1抗体如nivolumab，或增加帮助信号的PADREs(pan-DR binding peptide epitopes)因子如α干扰素，或细胞治疗，或激素治疗，或免疫源性化疗或传统化疗。[0007]研究表明，有一种分子MUC1和肿瘤关系密切，已经成为肿瘤免疫治疗的靶点。证据来自于以下7个方面：(1)单克隆抗体研究发现，正常上皮细胞存在MUC1低表达，而癌症时(例如乳腺、卵巢和肾)MUC1高表达(增加100倍)；癌症发生时MUC1存在于整个细胞表面，而正常组织局限在分泌细胞的顶端表面。(2)已经发现MUC1在鼠中有很高的免疫原性，如通过用人类癌症细胞免疫鼠来制造单克隆抗体，几乎所有的抗体都和高免疫原性VNTR(PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA)40-80反应，事实上是和这个区域中APDTR氨基酸反应。(3)癌细胞表面糖类存在异常糖基化，形成新的糖表位(Tn,STn和TF)和肽表位的暴露(例如在VNTR的APDTRPA)。(4)已经证明从乳腺癌和胰腺癌病人的引流淋巴结中获得的T细胞是以非MHC限制性的方式识别MUC1癌细胞。(5)在乳腺癌病人中发现MHC限制的细胞毒性T淋巴细胞，从癌症病人身上获得针对MUC1 VNTR区的抗体。(6)在头/颈癌(舌、喉、咽和扁桃体的)、食管的鳞状细胞癌、胆囊癌、肝细胞癌、尿道癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、急性/慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、浆细胞瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤中也发现MUC1过表达。(7)MUC1表达在癌症祖/干细胞。所有的这些特征形成了肿瘤免疫研究中MUC1作为靶点研究的基础。
[0008]国外以MUC1的VNTR为基础的肽结合或混合多种固有免疫系统的固有刺激物的疫苗进行了I期临床试验。佐剂包括SB-AS2、不完全弗氏佐剂和钥孔虫戚血兰素(KLH)等。两个非糖基化的VNTR剂型已经非常成功地进入III期临床试验。第一个是Stimuvax(Merck,NJ,USA)，它是一个25聚体的VNTR MUC1肽被脂质体包裹，并联合一个Toll样受体-4激动剂(脂质A)，现在在进行三个III期临床试验：两个在非小细胞肺癌(NSCLC),一个在雌激素受体阳性的乳腺癌联合激素治疗。这些试验中基于IIB期研究获得令人鼓舞的结果，即证明了处于IIIB阶段NSCLC(限于局部的疾病)的一群病人，接受Stimuvax和最高标准护理的中位生存期为30.6个月，而只接受最高标准护理的病人的中位生存期为13.3个月。最近一千多人的III期肺癌治疗试验表明癌症疫苗总体治疗效果并不明显，可能和入组的是晚期肺癌患者有关系。通过分组发现以下规律：吸烟患者(n＝762)的治疗效果好于非吸烟的患者，中位数生存时间从20.6个月延长到32.1个月(p＝0.0058)；女性患者(n＝269)的中位数生存时间从20.6个月延长到36.8个月(p＝0.0370)，非腺癌患者(n＝496)的中位数生存时间从19.6个月延长到29.6个月(p＝0.0435)；同时合并化疗的患者(n＝806)中位数生存时间从20.6个月延长到30.8个月(p＝0.0175)的研究显示，相对于化疗后使用疫苗的患者，只有化疗和
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疫苗同时使用的患者受益。第二个是MUC1(100聚体)联合被氧化的甘露聚糖，它已经被使用很多年，在临床前、I期和II期试验和III期试验的研究中证明了有效性。总共31名绝经后的乳腺癌II期病人在36周内被免疫了甘露聚糖-MUC1 9次，并且联合他莫昔芬。安慰剂组15名病人中有4名复发，而用氧化甘露聚糖-MUC1治疗的16名病人中没有发生复发(p＝0.0292)。13位接受疫苗的患者中9位检测到MUC1的抗体，10位接受疫苗的患者中4位检测到MUC1特异性T细胞反应。安慰剂组未出现MUC1特异性免疫反应。12-15年随访III期临床研究表明：安慰剂组的乳腺癌复发率为60％(6/15)，使用癌症疫苗的患者乳腺癌复发率为12.5％(2/16)，寿命显著延长，总体使用癌症疫苗后无癌患者的百分比极显著增加；病人从未出现疫苗引起的毒性和自身免疫病，疫苗注射保证这些乳腺癌患者7年内无癌症复发。[0009]临床试验还表明癌症疫苗对6位胰腺癌患者都是安全的，其中1位患者病情稳定。包含40位前列腺癌患者的II期临床试验表明，癌症疫苗改善了13位患者的PSA倍增时间，其中10位PSA稳定了8个月。对11位卵巢癌患者的研究表明，癌症疫苗可以诱导抗体的产生，是安全的。包含37位肾细胞癌患者的II期临床试验表明，部分病人病情稳定时间达到6个月以上。根据肝癌、结直肠癌、甲状腺癌的抗原表达情况，癌症疫苗可能适合这部分肿瘤患者的治疗。1例不能手术的复发胃癌患者使用使用抗原诱导DC细胞局部治疗，30个月内未出现复发。对15位多发性骨髓瘤患者的I/II期临床试验研究表明，应用癌症疫苗的大部分患者病情稳定(至少17.5～41.3个月)，出现T细胞和B细胞的特异性免疫。I期临床试验研究表明，肝脏转移结直肠癌患者经肝转移手术切除后使用表达GM-CSF的异种癌细胞疫苗，同时静脉低剂量给予环磷酰胺，患者产生抗MUC1的抗体，9位患者中6位存活时间超过3年，4位再无复发。II期临床研究发现，74位患者使用DC细胞治疗和疫苗治疗，结直肠癌患者的2年无复发生存率相近(分别为47％和55％)，都好于非免疫组。39位晚期结肠腺瘤(结肠癌前病变)接种癌症疫苗后，17位产生抗MUC1的抗体和长期免疫记忆，而剩余未产生抗体的22位患者是因为接种疫苗前血液中的髓系抑制细胞数量较多有关。对于急性骨髓性白血病等疾病，使用免疫佐剂Montanide ISA-51可能是有害的。
[0010]虽然治疗性癌症疫苗Stimuvax对病人的寿命延长没有达到临床期望，但是，对于治疗性癌症疫苗的研究并未就此终止，我们设想通过改变治疗性癌症疫苗分子结构，增加疫苗的免疫原性，从而为癌症疫苗的临床应用创造条件。发明内容
[0011]本发明的目的是提供一种肺癌的抗原蛋白及其编码基因和治疗性肺癌疫苗的制备方法。
[0012]第一方面，本发明提供一种肺癌的抗原蛋白，包括如下(a)或(b)的蛋白质：[0013](a)由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列组成的蛋白质，[0014](b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。[0015]第二方面，本发明提供一种编码第一方面中的抗原蛋白的编码基因。[0016]在第二方面的第一种可能实现的方式中，所述DNA分子的上游和下游还分别包括一个酶切位点，上游的酶切位点为NdeI酶切位点；下游的酶切位点为NcoI酶切位点。[0017]第三方面，本发明提供一种含有第二方面或第二方面的第一种可能实现方式所述
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的编码基因的重组表达载体。
[0018]在第三方面的第一种可能实现的方式中，所述重组表达载体的出发载体为pMAL-p5X。
[0019]第四方面，本发明提供一种含有第三方面所述的重组表达载体的重组菌或转基因细胞系。
[0020]第五方面，本发明提供一种治疗性肺癌疫苗的制备方法，包括：
[0021](1)用加有氨苄青霉素的培养基活化带有第三方面所述重组表达载体的DH5α菌株，然后加入IPTG诱导表达，离心收集细菌培养基；
[0022](2)向细菌培养基加入硫酸铵水溶液沉淀后悬起进行亲和纯化和麦芽糖水溶液洗脱，得到纯化的蛋白质；
[0023](3)对纯化的蛋白质进行超滤浓缩，得到目的蛋白质；[0024](4)对目的蛋白质去毒处理，然后加入佐剂混合，得到治疗性肺癌疫苗。[0025]在第五方面的第一种可能实现的方式中，步骤(2)中，硫酸铵的质量浓度为26.3％-53.0％。
[0026]在第五方面的第二种可能实现的方式中，步骤(2)中，麦芽糖水溶液浓度为10mmol/L。
[0027]在第五方面的第三种可能实现的方式中，所述佐剂为氢氧化铝佐剂。
[0028]本发明提供的一种肺癌的抗原蛋白及其编码基因和治疗性肺癌疫苗的制备方法，首先选用的MUC1多肽表位靶点(为方便描述，命名为MNR)，该靶点是正常细胞没有的，只有癌症细胞和癌前期细胞特异表达，具有很好的安全性。其次选择的佐剂Cs直接和MNR通过基因融合重组表达偶联，增加了MNR蛋白的免疫原性。然后，选择临床常用的铝佐剂作为辅料，增加疫苗的作用时间。最后获得的癌症疫苗通过肌肉注射，动物实验表明具有很好的安全性和有效性。
附图说明
[0029]图1为本发明所提供的抗原蛋白在大肠杆菌中重组表达的电泳图；[0030]图2为本发明所提供的抗原蛋白从细菌培养基中纯化的电泳图；[0031]图3为本发明所提供的抗原蛋白超滤浓缩后的电泳图；
[0032]图4为MBP和本发明所提供的抗原蛋白从细菌培养基的纯化对比电泳图；[0033]图5为本发明所提供的抗原蛋白的酶切鉴定电泳图；[0034]图6为本发明所提供的抗原蛋白穿柱后的电泳图；[0035]图7为本发明所提供的抗原蛋白亲和纯化后的电泳图；[0036]图8为试验例1结果示意图；
[0037]图9为试验例2中第一个试验的结果示意图；[0038]图10为试验例2中第二个试验的结果示意图；
具体实施方式
[0039]为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
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实施例1
[0041]抗原蛋白合成：使用Gene Designer软件对编码基因进行密码子优化，并在基因上游引入NdeI内切酶位点，下游引入NcoI内切酶位点，合成基因克隆入pUC57载体，氨苄抗性。基因合成后用NdeI和NcoI内切酶双酶切，连接入经过同样酶切的pMAL-p5X质粒，并用DNA连接酶连接，转化到感受态DH5α细菌，用含有氨苄(AMP)的琼脂培养板上筛选，挑选单克隆用LB-AMP培养基培养，提取质粒酶切鉴定，然后进行测序鉴定。将含有编码基因的pMAL-p5X质粒(为方便描述，将该质粒命名为pMAL-p5X-MNR)的DH5α细菌用LB-AMP培养，待OD600nm达到0.5加入终浓度为1mM的IPTG，诱导表达12h。同样诱导表达带有pMAL-p5X的DH5α细菌做为对照。取诱导前后的菌液进行蛋白质电泳，考马斯亮蓝R250染色。DH5α-pMAL-p5X-MNR表达出约65KD的蛋白质(如图1右指箭头所示)，而对照细菌DH5α-pMAL-p5X表达出约48KD的蛋白质(如图1左指箭头所示)。[0042]经检测，抗原蛋白的一级结构如序列表SEQ ID NO：1所示。其基因编码序列如序列表SEQ ID NO：2所示。[0043]实施例2
[0044]抗原蛋白的衍生蛋白合成：使用Gene Designer软件对编码基因进行密码子优化，并在基因上游引入BamHI内切酶位点，下游引入EcoRI内切酶位点，合成基因克隆入pUC57载体，氨苄抗性。基因合成后用BamHI和EcoRI内切酶双酶切，连接入经过同样酶切的pMAL-p5X质粒，并用DNA连接酶连接，转化到感受态DH5α细菌，用含有氨苄(AMP)的琼脂培养板上筛选，挑选单克隆用LB-AMP培养基培养，提取质粒酶切鉴定，然后进行测序鉴定。将含有编码基因的pMAL-p5X质粒的DH5α细菌用LB-AMP培养，待OD600nm达到0.5加入终浓度为1mM的
考马斯亮蓝R250染色。经检测，抗IPTG，诱导表达12h。取诱导前后的菌液进行蛋白质电泳，
原蛋白的一级结构如序列表SEQ ID NO：3所示。其基因编码序列如序列表SEQ ID NO：4所示。
[0045]实施例3
[0046]抗原蛋白的衍生蛋白合成：使用Gene Designer软件对编码基因进行密码子优化，并在基因上游引入NcoI内切酶位点，下游引入EcoRI内切酶位点，合成基因克隆入pUC57载体，氨苄抗性。基因合成后用NcoI和EcoRI内切酶双酶切，连接入经过同样酶切的pMAL-p5X质粒，并用DNA连接酶连接，转化到感受态DH5α细菌，用含有氨苄(AMP)的琼脂培养板上筛选，挑选单克隆用LB-AMP培养基培养，提取质粒酶切鉴定，然后进行测序鉴定。将含有编码基因的pMAL-p5X质粒的DH5α细菌用LB-AMP培养，待OD600nm达到0.5加入终浓度为1mM的IPTG，诱导表达12h。取诱导前后的菌液进行蛋白质电泳，考马斯亮蓝R250染色。经检测，抗原蛋白的一级结构如序列表SEQ ID NO：5所示。其基因编码序列如序列表SEQ ID NO：6所示。
[0047]实施例4
[0048]1.抗原蛋白纯化
[0049]用加有氨苄青霉素的LB培养基培养活化带有pMAL-p5X-MNR的DH5α菌株，转接到加有氨苄青霉素的大瓶LB培养基培养，待OD600nm达到0.5加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导表达12h。离心收集细菌沉淀和培养基。[0050]细菌沉淀的处理：细菌沉淀用Tris缓冲液(配比为20mmol/L Tris-HCl，0.2mmol/
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LNaCl，10mmol/Lβ-巯基乙醇，1mmol/L EDTA)悬起，超声破碎10min，离心收集上清液，用微孔滤膜过滤后上8柱床Tris缓冲液平衡的Amylose树脂，用12柱床Tris缓冲液洗涤后，再用含10mM麦芽糖的Tris缓冲液洗脱，获得目的蛋白质。取洗脱的蛋白质变性后上聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝R250染色。[0051]细菌培养基的处理：细菌培养基用硫酸铵沉淀后悬起上amylose树脂，用10mmol/L麦芽糖洗脱。用于细菌沉淀处理中同样方法进行电泳和染色鉴定纯化成分。采用Brandford法测定蛋白浓度，将纯化获得的抗原蛋白加入到Millipore超滤离心管(MWCO 10000)中，4000×g离心15min，蛋白质得以浓缩。对浓缩的蛋白质用同样方法测定浓度，并稀释20倍后进行蛋白质电泳。细菌菌液经内压式滤膜过滤除菌，滤液再经外压式滤膜浓缩。浓缩液经过10K滤膜透析2次，离心后上Amylose亲和树脂纯化得到目的蛋白，然后用G250检测后上SDS-PAGE分析。
[0052]对照细菌表达：用加有氨苄青霉素的LB培养基培养带有pMAL-p5X的DH5α菌株，待OD600nm达到0.5加入终浓度为1mmol/L的IPTG，用硫酸铵沉淀诱导表达12h。离心收集培养基，后悬起上mylose树脂，10mM麦芽糖洗脱。电泳和染色鉴定纯化成分。[0053]结论：
[0054](1)将细菌培养基用26.3％硫酸铵沉淀,可以得到分子量约为65KD的蛋白质；加大硫酸铵的浓度到33.3％和53.0％，还可以沉淀相当量的分子量约为65KD的蛋白质。高于53.0％硫酸铵沉淀的蛋白质杂质较多。65KD的蛋白质能被Amylose树脂结合和10mmol/L麦芽糖洗脱，得到浓度较高的蛋白质，其分子量和MUC1-N可变串联重复MBP融合蛋白分子量理论值64.9KD一致。(如图2箭头所示)
[0055](2)纯化的蛋白质经过10KD超滤管离心过滤后得以浓缩(见图3箭头所指)，有少量蛋白质漏出，漏出的蛋白质仍可结合Amylose树脂结合并被10mM麦芽糖洗脱。超滤浓缩的蛋白质浓度达到5mg/ml。-20℃保存一周后，蛋白质有部分降解。[0056](3)为了印证纯化的蛋白质是带有MNR基因的目的蛋白，我们将对照质粒(只含MBP基因)转化的DH5α进行诱导表达，并进行培养基的硫酸铵沉淀和Amylose树脂纯化。发现从培养基纯化的蛋白质分子量和MBP一致，比MNR-MBP分子量小。前者在硫酸铵浓度为50-67％的蛋白沉淀量大于20-50％的蛋白沉淀量，后者硫酸铵浓度为20-50％的蛋白沉淀量大于50-67％的蛋白沉淀量,见图4。
[0057](4)蛋白质经过室温3h处理后已经基本酶解，21h后已经完全酶解。得到分子量约17KD的蛋白质，和MNR的分子量比较接近(160个氨基酸残基，见图5箭头所指)。经过Q-Sepharose纯化,穿柱液中得到17KD的蛋白质(见图6箭头所指)[0058](5)SDS-PAGE分析表明，细菌菌液经＜200K型内压式滤膜过滤后上清液含有目的蛋白质，经CLW-002型外压式滤膜后浓缩近3倍，经Amylose亲和树脂纯化得到浓度较高的目的蛋白质，见图7。
[0059]2.目的蛋白(命名为MNR-MBP)去内毒素
[0060]超滤浓缩后的MNR-MBP经过Tris缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，0.2mol/LNaCl，10mmol/Lβ-巯基乙醇，1mmol/L EDTA)平衡，用微孔滤膜过滤后上8柱床Tris缓冲液平衡的Amylose树脂，用12柱床Tris缓冲液洗涤后用含10mmol/L麦芽糖的Tris缓冲液洗脱，获得目的蛋白质MNR-MBP。用Q-sepharose穿柱去除内毒素，柱床1.6ml,用pH 7.4的Tris缓冲液平
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衡后上样,穿柱液过0.22μm滤膜除菌，用Braford法测定蛋白质含量，用鲎试剂测定内毒素含量，当内毒素含量低于500EU/mg为合格，若达不到合格标准再重复去除内毒素步骤直到合格为止，稀释目的蛋白MNR-MBP溶液到1mg/ml保存。
[0061]实验采用多种方式去除目的蛋白MNR-MBP的内毒素,其中包括硫酸铵沉淀二次、过Amylose树脂后洗脱后再超滤、Octyl-sepharose穿柱、Q-sepharose穿柱，只有超滤后过亲和柱加Q-sepharose穿柱纯化能够达到要求，内毒素的含量低于500Eu/mg。[0062]3.肺癌疫苗的制备
[0063]于双蒸水中加入1％明胶、5％蔗糖、0.65％的NaCl、0.9mg/ml的AlCl3，用10N NaOH调节pH到5.8。110℃高压蒸气灭菌20min，冷却后过0.22μm滤膜，收集滤出液为氢氧化铝佐剂，4℃保存备用。取0.5ml氢氧化铝佐剂加入0.5mg MNR-MBP目的蛋白，混合均匀成为肺癌疫苗。该肺癌疫苗为透明、无臭、无味液体。在25±0.5℃时的pH为6.0～8.0。[0064]总体上，本发明肺癌疫苗制备过程如下：通过基因工程在宿主菌中表达MNR-MBP，后经过多重纯化、去毒、过滤除菌得到注射级别的MNR-MBP，经鲎试剂内毒素检测达到要求。合成路线：基因制备→质粒构建→重组表达→超滤纯化→亲和纯化→去毒→过滤除菌→辅料添加→成品包装。工艺描述：注册批量为12g/批，商业化大生产批次的拟定批量为750/批。以注册批为代表的工艺描述如下：蛋白质粗品用Tris缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，0.2M NaCl，1mmol/L EDTA)透析，用微孔滤膜过滤后上8柱床Tris缓冲液平衡的Amylose树脂，用12柱床Tris缓冲液洗涤后用含10mmol/L麦芽糖的Tris缓冲液洗脱，获得目的蛋白质。[0065]试验例1
[0066]疫苗动物免疫实验
[0067]取10只6-8周龄雄性Balb/C小鼠，分成实验组和对照组。实验组右前腿肌肉注射100μL(50μg)疫苗(氢氧化铝为佐剂，溶于20mmol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH值为7.4)，对照组同样部位注射100μL氢氧化铝佐剂。每周两次，共3次。免疫前和免疫后2次眼眶取血用于抗体的检测。ELISA检测发现：疫苗免疫前Balb/C小鼠血清中不存在MNR的抗体，7天后出现少量的针对在MNR的抗体，14天后出现约多的MNR的抗体，只注射免疫佐剂没有出现MNR的抗体，见图8。[0068]试验例2
[0069]疫苗的药效学实验
[0070]2.1取49只6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠，分成生理盐水组(对照组)、50μg实验组(本发明疫苗)，每组7只。每两周注射1次，共3次。在第3次免疫后第4日，右侧腋下注射1×106(50μL)肺癌细胞，14天后测量小鼠肿瘤的体积。结果发现和对照组相比，50μg实验组的肿瘤极显著变小，见图9。
[0071]2.2取28只6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠，分成4组注射50μg实验组(本发明疫苗)，每组7只。每两周注射1次，分别注射2、4、6、8次。在最后一次免疫后第4日，右侧腋下注射1×106(50μL)肺癌细胞，14天后测量小鼠肿瘤的体积。结果发现免疫次数越多，肿瘤的体积越小，见下图10。
[0072]2.3取10只6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠，右侧腋下注射1×106(50μL)黑色素瘤细胞，第8天后测量小鼠肿瘤的体积。分成2组注射生理盐水和50μg实验组(本发明疫苗)，每组5只。每周注射2次，并在第12、14、16天测定肿瘤大小。结果发现肿瘤生长的第14天，本发明
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说 明 书
8/8页
疫苗注射抑制了黑色素瘤的生长，见表1。
[0073]表1本发明疫苗注射抑制黑色素瘤的生长
[0074]
试验例3
[0076]疫苗动物毒理学试验
[0077]取10只6-8周龄雄性Balb/C小鼠，分成实验组和对照组。实验组右前腿肌肉注射100μL(50μg)本发明疫苗(氢氧化铝为佐剂，溶于20mmol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH值为7.4)，对照组同样部位注射100μL氢氧化铝佐剂。每周两次，共3次。动物接种疫苗后14天处死动物观察动物未见心脏、肝脏、脾、肺、肾等脏器的器质性病变。[0078]试验例1-3为针对本发明抗原蛋白制得肺癌疫苗的试验，经过同样的试验手段检
在此不再赘述。测，发现实施例2和3提供的衍生蛋白制得的疫苗也具有相同的效果，
[0079]应用实施例1
[0080]疫苗临床应用方法[0081]第一个疗程一年，第1-4针间隔一周，第5-15针间隔1月。癌症早期患者使用1年；癌症中期患者增加一疗程，第16-27针间隔1月，癌症早期患者使用2年。双侧上臂肌肉注射。[0082]以上对本发明所提供的一种肺癌的抗原蛋白及其编码基因和治疗性肺癌疫苗的制备方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
[0075]
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序 列 表
1/18页
SEQUENCE LISTING<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> 肺癌的抗原蛋白及其编码基因和治疗性肺癌疫苗的制备方法<130> P20160046<160> 6
<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 573<212> PRT
<213> 人工序列<400> 1
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys 20 25 30
Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu 35 40 45
Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu 50 55 60
His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly65 70 75 80
11
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序 列 表
2/18页
Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr 85 90 95
Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln 100 105 110
Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys 115 120 125
Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn 130 135 140
Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala145 150 155 160
Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn 165 170 175
Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly 180 185 190
Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly 195 200 205
Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu 210 215 220
Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu225 230 235 240
12
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序 列 表
3/18页
Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp 245 250 255
Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val 260 265 270
Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu 275 280 285
Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu 290 295 300
Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn305 310 315 320
Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu 325 330 335
Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys 340 345 350
Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala 355 360 365
Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp 370 375 380
Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn
13
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序 列 表
4/18页
385 390 395 400
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile Glu Gly Arg Ile Ser His Met 405 410 415
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 420 425 430
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 435 440 445
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 450 455 460
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser465 470 475 480
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 485 490 495
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 500 505 510
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 515 520 525
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 530 535 540
14
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序 列 表
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Ser Met Gly Gly545 550 555 560
Arg Asp Ile Val Asp Gly Ser Glu Phe Pro Ala Gly Asn 565 570
<210> 2<211> 420<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtgttactt ctgctcctga tactcgtcct gctcctggtt ctactgcacc gccagcacatggcgtgacgt ctgcgccaga tacccgtccg gcaccgggtt ccaccgcccc accggcacacggcgtaacct ccgcgccaga cacccgtcca gcgccaggtt ctaccgctcc gcctgctcatggtgttacct ctgccccgga cactcgtccg gctccaggtt ctactgcccc gccagctcatggcgtcactt ccgccccgga tacccgtcct gccccgggct ctactgcgcc tccggctcacggcgttacct ctgcaccgga tactcgtccg gctccgggct ctaccgcacc acctgctcatggcgtaacga gcgctcctga tacccgtccg gctccgggtt ccactgcacc tccggcccac<210> 3<211> 713<212> PRT
<213> 人工序列<400> 3
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr1 5 10 15
15
5/18页
60120180240300360420
CN 105906699 A
序 列 表
6/18页
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys 20 25 30
Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu 35 40 45
Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu 50 55 60
His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly65 70 75 80
Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr 85 90 95
Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln 100 105 110
Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys 115 120 125
Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn 130 135 140
Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala145 150 155 160
Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn 165 170 175
16
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序 列 表
7/18页
Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly 180 185 190
Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly 195 200 205
Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu 210 215 220
Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu225 230 235 240
Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp 245 250 255
Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val 260 265 270
Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu 275 280 285
Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu 290 295 300
Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn305 310 315 320
Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu
17
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序 列 表
8/18页
325 330 335
Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys 340 345 350
Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala 355 360 365
Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp 370 375 380
Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn385 390 395 400
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile Glu Gly Arg Ile Ser His Met 405 410 415
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 420 425 430
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 435 440 445
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 450 455 460
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser465 470 475 480
18
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序 列 表
9/18页
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 485 490 495
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 500 505 510
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 515 520 525
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 530 535 540
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser545 550 555 560
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 565 570 575
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 580 585 590
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 595 600 605
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 610 615 620
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser625 630 635 640
19
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序 列 表
10/18页
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 645 650 655
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 660 665 670
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 675 680 685
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Ser Met Gly Gly Arg Asp Ile Val 690 695 700
Asp Gly Ser Glu Phe Pro Ala Gly Asn705 710
<210> 4<211> 840<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtgttactt ctgctcctga tactcgtcct gctcctggtt ctactgcacc gccagcacatggcgtgacgt ctgcgccaga tacccgtccg gcaccgggtt ccaccgcccc accggcacacggcgtaacct ccgcgccaga cacccgtcca gcgccaggtt ctaccgctcc gcctgctcatggtgttacct ctgccccgga cactcgtccg gctccaggtt ctactgcccc gccagctcatggcgtcactt ccgccccgga tacccgtcct gccccgggct ctactgcgcc tccggctcacggcgttacct ctgcaccgga tactcgtccg gctccgggct ctaccgcacc acctgctcat20
60120180240300360
CN 105906699 A
序 列 表
11/18页
ggcgtaacga gcgctcctga tacccgtccg gctccgggtt ccactgcacc tccggcccac 420ggtgttactt ctgctcctga tactcgtcct gctcctggtt ctactgcacc gccagcacat 480ggcgtgacgt ctgcgccaga tacccgtccg gcaccgggtt ccaccgcccc accggcacac 540ggcgtaacct ccgcgccaga cacccgtcca gcgccaggtt ctaccgctcc gcctgctcat 600ggtgttacct ctgccccgga cactcgtccg gctccaggtt ctactgcccc gccagctcat 660ggcgtcactt ccgccccgga tacccgtcct gccccgggct ctactgcgcc tccggctcacggcgttacct ctgcaccgga tactcgtccg gctccgggct ctaccgcacc acctgctcatggcgtaacga gcgctcctga tacccgtccg gctccgggtt ccactgcacc tccggcccac<210> 5<211> 853<212> PRT
<213> 人工序列<400> 5
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys 20 25 30
Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu 35 40 45
Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu 50 55 60
21
720780840
CN 105906699 A
序 列 表
12/18页
His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly65 70 75 80
Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr 85 90 95
Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln 100 105 110
Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys 115 120 125
Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn 130 135 140
Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala145 150 155 160
Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn 165 170 175
Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly 180 185 190
Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly 195 200 205
Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu 210 215 220
22
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序 列 表
13/18页
Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu225 230 235 240
Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp 245 250 255
Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val 260 265 270
Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu 275 280 285
Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu 290 295 300
Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn305 310 315 320
Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu 325 330 335
Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys 340 345 350
Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala 355 360 365
Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp
23
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序 列 表
14/18页
370 375 380
Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn385 390 395 400
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile Glu Gly Arg Ile Ser His Met 405 410 415
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 420 425 430
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 435 440 445
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 450 455 460
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser465 470 475 480
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 485 490 495
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 500 505 510
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 515 520 525
24
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序 列 表
15/18页
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 530 535 540
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser545 550 555 560
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 565 570 575
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 580 585 590
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 595 600 605
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 610 615 620
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser625 630 635 640
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 645 650 655
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 660 665 670
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 675 680 685
25
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序 列 表
16/18页
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 690 695 700
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser705 710 715 720
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 725 730 735
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 740 745 750
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 755 760 765
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 770 775 780
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser785 790 795 800
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 805 810 815
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 820 825 830
Pro Pro Ala His Ser Met Gly Gly Arg Asp Ile Val Asp Gly Ser Glu 835 840 845
26
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序 列 表
17/18页
Phe Pro Ala Gly Asn 850
<210> 6<211> 1260<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtgttactt ctgctcctga tactcgtcct gctcctggtt ctactgcacc gccagcacatggcgtgacgt ctgcgccaga tacccgtccg gcaccgggtt ccaccgcccc accggcacacggcgtaacct ccgcgccaga cacccgtcca gcgccaggtt ctaccgctcc gcctgctcatggtgttacct ctgccccgga cactcgtccg gctccaggtt ctactgcccc gccagctcatggcgtcactt ccgccccgga tacccgtcct gccccgggct ctactgcgcc tccggctcacggcgttacct ctgcaccgga tactcgtccg gctccgggct ctaccgcacc acctgctcatggcgtaacga gcgctcctga tacccgtccg gctccgggtt ccactgcacc tccggcccacggtgttactt ctgctcctga tactcgtcct gctcctggtt ctactgcacc gccagcacatggcgtgacgt ctgcgccaga tacccgtccg gcaccgggtt ccaccgcccc accggcacacggcgtaacct ccgcgccaga cacccgtcca gcgccaggtt ctaccgctcc gcctgctcatggtgttacct ctgccccgga cactcgtccg gctccaggtt ctactgcccc gccagctcatggcgtcactt ccgccccgga tacccgtcct gccccgggct ctactgcgcc tccggctcacggcgttacct ctgcaccgga tactcgtccg gctccgggct ctaccgcacc acctgctcatggcgtaacga gcgctcctga tacccgtccg gctccgggtt ccactgcacc tccggcccac27
60120180240300360420480540600660720780840
CN 105906699 A
序 列 表
18/18页
ggtgttactt ctgctcctga tactcgtcct gctcctggtt ctactgcacc gccagcacat 900ggcgtgacgt ctgcgccaga tacccgtccg gcaccgggtt ccaccgcccc accggcacac 960ggcgtaacct ccgcgccaga cacccgtcca gcgccaggtt ctaccgctcc gcctgctcat 1020ggtgttacct ctgccccgga cactcgtccg gctccaggtt ctactgcccc gccagctcat 1080ggcgtcactt ccgccccgga tacccgtcct gccccgggct ctactgcgcc tccggctcacggcgttacct ctgcaccgga tactcgtccg gctccgggct ctaccgcacc acctgctcatggcgtaacga gcgctcctga tacccgtccg gctccgggtt ccactgcacc tccggcccac28
114012001260
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说 明 书 附 图
1/3页
图1
图2
图3
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说 明 书 附 图
2/3页
图4
图6
图5
图7
图8
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说 明 书 附 图
3/3页
图9
图10
31
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