硫酸铵沉淀和层析法分离纯化纳豆激酶的研究

文章编号

利用生产纳豆激酶的Bacillus subtilis进行深层发酵20

Superdex 75凝胶过滤层析和SP Sepharose Fast Flow离子交换层析对活性组分进行分离提纯

并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对分离纯化的效果进行了检验

分子量27.7 kD

关键词

凝胶层析

A

Separation and Purification of Nattokinase Produced by Bacillus Subtilis with

Ammonium Sulfate Precipitation and Chromatography

GAO Da-hai1, MEI Le-he1, SHENG Qing2, XU Jing3, LIN Dong-qiang1, YAO Shan-jing1 (1. Department of Chemical and Biochemical Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China; 2. College of Life Science, Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310018, China;

3. Hangzhou East-China Pharmaceutical Company, Hangzhou 310011, China)

Abstract: In order to obtain high purity nattokinase from the fermentation broth of Bacillus subtilis, some separation and purification techniques were explored. The optimized separation and purification process includes the following steps: removing cells by the centrifugation, 20%~60% saturation ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography with Superdex 75 and ion-exchange chromatography with SP Sepharose Fast Flow. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was used to examine the purification effect, and the results indicate that the final product obtained is homogeneous and has a molecular weight around 27.7 kD. The fibrinolytic activity of the nattokinase was measured by means of fibrin plate method. The purification factor and activity recovery of the nattokinase are 8.4 and 49%, respectively. The specific activities of purified nattokinase could reach 28530 IU⋅mg−1. The results demonstrate that the combination of bioseparation process of ammonium sulfate precipitation with gel filtration and ion exchange chromatography is suitable for the separation and purification of nattokinase from culture broth of Bacillus subtilis. Especially for lab scale, the process mentioned above can be easily performed as an efficient way to prepare pure nattokinase with high yield.

Key words: nattokinase; purification; gel filtration; ion-exchange chromatography

1 前 言

血栓性疾病严重威胁着人类的生命与健康

2004-03-19

基金项目

高大海(1980-)

±±¾©ÈË

３０５７０４１１）

通讯联系人

meilh@che.zju.edu.cn

浙江省回国人员基金项目

万方数据 高 校 化 学 工 程 学 报 2006年2月

选方法如尿激酶

难以成为适用的大众药品[1]

173种食品对血栓的溶解作用

存在半衰期短

ËüÓɴ󶹷¢

½ÍÖƳÉÈÕ±¾µÄÐë¼ûÑóÐнÌÊÚ¿¼²ìÁË

定名为纳豆激酶(nattokinase, NK)[2]

NK是一种丝氨酸蛋白酶

能刺激静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂(t-PA)

传统的纳豆激酶的分离方法主要是以纳豆为原料过滤层析

经过多步分离

层发酵获得的含纳豆激酶发酵液活力高液中分离提纯纳豆激酶的工艺条件

Sephadex 凝胶

由于从纳豆中提取

而采用深

所以本文主要研究了从发酵

并

2 材料和方法

2.1 实验材料

菌种

纤维蛋白原(Fibrinogen)为Sigma公司产品

凝胶层析介质Superdex 75

µçÓ¾ÒÇ

Mini-PROTEAN 3 system 为Bio-RAD公司产品产

集团上海化学试剂公司生产

LB固体培养基

１５　ｇ⋅L−1琼脂

采用LB液体培养基

ｐＨ７．０

胰蛋白胨 22.7 g⋅L−1

0.2 g⋅L−1

发酵条件

以4

Na2HPO4 5.37 g⋅L−1

CaCl2

5 g⋅L−1酵母提取物

5 g⋅L−1酵母提取物

木糖由开化木糖厂生巴比妥钠为中国医药

酶活测定参照Astrup法制备纤维蛋白平板[7]

·ÅÖÃ

20

50

10 min培养箱

以标准酶活力为横坐标

计算各溶圈面积

冷冻离心

将研细的(NH4)2SO4按照20

下离心30 min

离心时间10 min

再在10000 r⋅min−1

下保存过夜

取上清液加硫酸铵至60%饱和度

万方数据第20卷第1期 高大海等

弃去上清液

2.4.2 Superdex 75凝胶层析

用上述酶液

2.4.3 Sepharose Fast Flow 离子交换层析

将Superdex 75凝胶层析的洗脱液合并

分部收集洗脱液

标准蛋白的分子量分别为

以1.0 mL⋅min−1的流速进行Superdex 75凝胶层析

用磷酸缓冲液洗柱后

取100mL加入硫酸铵达到20%饱和度

离心弃去上清

纯化倍数和回收率分别为1.8和80.6

结果如表1所示

³ýÈ¥¹ÌÌå¿ÅÁ£

ÖùÌå»ýΪ24mL

上柱前预先用10mmol⋅L−1

ÉÏÖùºóÓÃÉÏÊö»º³åҺϴ

ÍÑÖÁÔÚ280nm 波长无光吸收

发现第4

5号试管所对应的就

是纳豆激酶的吸收峰还起到了脱盐的作用

因为经过硫酸铵沉淀得到的粗酶中离子强度

非常高

甚至完全丧失吸附能力凝胶层析的纯化倍数为3.9

5号试管混合并进行SDS-PAGE分析(图4)

·Ö×ÓÁ¿²î±ð²»´ó

图1 Superdex 75 凝胶层析的洗脱曲线 Fig.1 Superdex 75 gel filtration of nattokinase

after salting-out with ammonium sulfate

表2 Superdex 75 凝胶层析分离纳豆激酶 Table 2 Superdex 75 gel filtration of nattokinase

Total activities of NK/IU Total protein / mg Recovery of NK / % Recovery of protein / % Specific activities / IU⋅mg−1

Purified factor

Sample 181700 30 100 100 6057 1

Eluent 141330 6.0 77.8 20 23555 3.9

万方数据66 高 校 化 学 工 程 学 报 2006年2月

3.3 离子交换层析纯化

选择离子交换进一步分离提纯纳豆激酶

[7]

且在pH 6~12的范围性质稳定

ＳＰ　

10 mmol⋅L−1 pH 6.4的磷酸缓冲液作为平衡液从两种介质的分离图谱分析

Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ的洗脱曲线见图3

MAU %B 80.0 60.0 40.0 20.0 Waste Waste 30.0 20.0 10.0 0.0 0 50 100 150 mL 0 20 40 60 80 min

图2 CM Sepharose Fast Flow离子交换层析谱图 gel filtration

图3 SP Sepharose Fast Flow离子交换层析谱图 Superdex 75 gel filtration

Fig.2 CM Sepharose Fast Flow IEC of nattokinase after Superdex 75

Fig.3 SP Sepharose Fast Flow IEC of nattokinase after

¶øÇҴ󲿷ÖÄɶ¹¼¤Ã¸²¢

ûÓÐÎü¸½ÔÚ½éÖÊÉÏ

¶øSP离子交换介质的分离效果

明显好于CM

将洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测

这个结果说明经过

离子交换层析的分离

从

表中可以看出

离子交换的纯化倍

数和回收率分别为1.2和78.7

表3 SP Sepharose Fast Flow 层析分离纳豆激酶

Table 3 SP Sepharose Fast Flow ion-exchange chromatography of

nattokinase

Total activities of NK/IU Total protein / mg Recovery of NK / % Recovery of protein / % Specific activities / IU⋅mg Purified factor

−1

Sample 141330 6.0 100 100 23555 1

Eluent 111270 3.9 78.7 65.0 28530 1.2

1 2 3 4

kD 97.0 66.0 45.0 30.0 20.1

27.7kD

Lane 1-molecular weight standard proteins; Lane 2-fermentation broth; Lane 3-Superdex 75 gel filtration; Lane 4-SP Sepharose Fast Flow ion-exchange chromatography.

(1) 由于分离样品属于胞外

产物

(3) 经离子交换后的精确分子量27,782相符[8]

14.4

图4 经过分离后的SDS-PAGE 电泳图 Fig.4 SDS-PAGE of purified nattokinase

这与文献报道的NK

万方数据第20卷第1期 高大海等

最终确定的分离纯化路线是

所得沉淀用10mmol⋅L−1 pH 6.4的磷酸缓冲液溶解后比活到达了28530 IU⋅mg−1 (蛋白)

收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析

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Ìõ´øµÄÄɶ¹¼¤Ã¸ÇұȻî·Ç³£¸ß

[9]

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以上实验表明

该方法尤其适用于实验室规模制备高纯度纳豆激酶但是通过本研究来设计出效率更高

这将有助于我们将

参考文献

万方数据