徐 冰
（天津农学院 农学系）
1 前言
β-内酰胺酶（青霉素酶）在自然界的各种细菌中广为存在, 能够水解各种β-内酰胺类抗生素, 是临床致病菌最重要的耐药机制之一。但同时我们可以利用许多非致病菌产生的β-内酰胺酶能够水解β-内酰胺类抗生素的特点, 开发其在抗生素药品质量检验、新抗菌药物筛选等方面的应用。
一些抗菌药物如青霉素、磺胺类药物、四环素及某些氨基糖甙类抗生素能使部分人群发生过敏反应。过敏反应症状多种多样,轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝织炎等;严重时可出现过敏性休克,甚至危及生命。当这些抗菌药物残留于动物性食品中进入人体后,就使部分敏感人群致敏,产生抗体。当这些被致敏的个体再接触这些抗生素或用这些抗生素治疗时,这些抗生素就会与抗体结合生成抗原抗体复合物,发生过敏反应。英国一对青霉素高度敏感的病人,食用约含10 IU/ mL 青霉素的商品牛奶后,发生了变态反应。在我们平常的生活中由于青霉素的大量使用使环境遭到了破坏，给人类带来了不便。
催化水解青霉素β-内酰环产生青霉噻唑酸的一类β-内酰胺酶。国际生物化学联合会（IUB）酶学委员会的酶编号为3.5.2.6。在各种微生物中分布广泛，特别在细菌中更为广泛。由蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus 5/B与B. cereus 569分别得到分子量为35200与31500的青霉素酶结晶，从巨大芽孢杆菌B. megaterium 提取出α，β，γ青霉素酶结晶，随后从不同细菌又分离出多种青霉素酶。青霉素酶对热极不稳定，分解β-内酰胺的速度因青霉素与酶的种类不同而异，但对6-氨基青霉烷酸（6-APA）作用却很微弱。酶反应最适PH值为6.0～6.5. 以青霉素G钾盐为底物，Km为4.32×10-3M(5/B酶)；4.89×10-3M(569酶)。细菌产生青霉素酶导致出现耐药性，临床上已分离出多种类型青霉素酶，白色粉末。分子量50000。溶于水。酶溶液易失活，冻干品2～8℃可稳定一周。青霉素酶作用于青霉素的β-内酰胺环，使青霉素转变为无抗菌活性的青霉素酮酸（penicilloic acid）。医疗上用于青霉素过敏症状的治疗。青霉素酶在实验中用于破坏或抑制青霉素活性
β-内酰胺酶（β-lactamase），可水解β-内酰胺类抗生素。已发现二百多种β-内
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酰胺酶。青霉素酶的分类方法主要有两种，分子生物学方法和BUSH法。
分子生物学法将酶分为四类。A类酶包括多种质粒编码的青霉素酶，活性部位为丝氨酸残基，分子量为29kDa。B类酶为金属酶，由染色体或质粒编码，酶活性需锌离子参与，可被乙二胺四乙酸（EDTA）抑制。C类酶的活性部位为丝氨酸残基，分子量为39kDa，其产生与诱导剂有关。C类酶主要指染色体编码的头孢菌素酶（AmpC酶）。D类酶又称为OXA型（水解苯唑西林）β-内酰胺酶。
另一种分类方法为BUSH分类法，依底物及抑制剂谱不同，也将酶分为4类。第一类为头孢菌素酶（AmpC酶），由染色体介导。第二类为青霉素酶和超广谱酶。第三类为金属酶。第四类为其它不能被克拉维酸完全抑制的青霉素酶。
由于青霉素的大量使用和乱用带来的一些危害，我们有必要来生产青霉素酶来分解青霉素，这样可以减少一些青霉素过敏反应带来的危害，也可以减少乱用青霉素带来的环境污染。这使青霉素敏感人群的安全性得到了进一步的提高，使我们的环境更加安全。
青霉素G 是目前医药工业中的最重要抗生素类产品,具有抗菌活性强,疗效高,毒性低等优点,一直是治疗敏感性细菌感染的首选药物。我国青霉素年生产能力达到12000 吨以上,占全球年产量的50 % ,是世界青霉素生产大国[2]。青霉素G结构中的β-内酰胺环不稳定,在酸、碱、高温、酶等作用下发生降解,生成的物质易与蛋白或多肽结合,生成致敏性高分子杂质,导致过敏反应的发生[3] 。青霉素过敏反应表现形式多种多样，以过敏性休克最为严重，常常发病迅速。其临床症状主要表现为呼吸道阻塞症状（呼吸困难、胸闷）;循环衰竭（大汗淋漓、紫绀、脉搏细弱、血压下降）;中枢神经系统紊乱（意识障碍、昏迷、抽搐、大小便失禁等）。目前工业生产中大多采用溶媒萃取法从发酵液中分离青霉素G,pH118～2. 5 时用乙酸丁酯进行萃取,pH6.8～8.0 时用碳酸氢钠进行反萃取,然而收率只有80 %～90 % ,据文献报道[4] ,其主要原因由青霉素G不稳定降解造成。
医学界流行一句话: 在美国买枪很容易, 但买抗生素却很难, 而中国正好相反。目前, 中国的门诊感冒患者约有75% 应用抗生素, 外科手术则高达95% , 世界卫生组织调查表示, 中国住院患者抗生素药物使用率高达80% , 其中使用广谱抗生素和联合使用两种以上抗生素的占58% , 远远高于30% 的国际水平[5]。 专家说凡超时、超量、不对症使用或未严格规范使用抗生素, 都属于抗生素滥用[6]。我们常看到这样的一种现象: 只要病人一到医院或诊所就医, 不管有没有感染症状, 医生动不动就上抗生素, 甚至全然不顾抗生素的副作用, 把抗生素当成预防和治疗感染的常规。 与此同时, 家庭中抗生素使用率也相当惊人,
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缺乏医学知识的群体对抗生素推崇备至, 许多家庭长期备有各种抗生素, 一有风吹草动, 边随便服用.临床上, 乱用、滥用抗生素现象有以下方面:
1) 对疾病发病原因不明而乱用抗生素。如用抗生素治疗流行性感冒和非细菌引起的喉病和肺炎等, 这些疾病均非细胞感染所致, 应用抗生素实无必要且不效, 因而, 感冒不一定要用抗生素[7]。
2) 随意选用新型广谱抗生素治疗普通抗生素就能治愈的疾病。这种“大炮打蚊子”式的用药方法, 不仅易导致细菌耐药, 而且造成大量浪费。
3) 不辨明致病菌类型而盲目求新、求贵、错误地以为, 药愈新, 价格愈贵, 疗效愈好,“撒大网”式的多种抗生素联用等。
4) 由于对抗生素的作用机理、抗菌谱和药代动力学参数等不明或知之甚少, 临床使用时, 抗生素的选用及剂量、疗程和给药途径等不当。
5) 药品广告的管理存在问题。大量媒介上可见抗生素广告, 病人上医院指定医生开广告上宣传的药品,即用药跟着广告走。
6) 随病人要求开人情处方。为了医院创收, 鼓励医生大量用第二代和第三代头孢菌素等进口抗生素, 或为了促销, 用手中的钱去换医生手中的笔等。 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 菌种
蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63301（Bacillus cereus），天津市大康科技股份有限公司。 2.1.2 培养基
（1）初始固体培养基（肉汤培养基）：10g蛋白胨、5g牛肉膏、5g NaCl、1L水，加热，调PH7.2~7.4,加入20g左右的琼脂。
（2）液体发酵培养基：蛋白胨15g、甘油50g、氯化钠4g、0.1％硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶液0.5mL、枸橼酸钠5.88g、20％硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶液1mL、磷酸氢二钾4g、肉浸液1000mL。混合上述成分，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，分装于500mL锥形瓶内,每瓶80mL,在115℃灭菌30分钟。 2.1.3 主要仪器
ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂 PH050A型 培养箱/干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司
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旋转式恒温调速摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司 电子天平（FA2004） 上海精科天平
电子天平 梅特勒-拖利多仪器（上海）公司
2.2 方法
利用浓度梯度平板筛选法筛选高产菌株，其中青霉素既是诱导剂也是筛选条件。 2.2.1 具体方法 2.2.1.1 液体发酵
首先用原始菌种进行发酵实验，确定其产酶效率：酶溶液的制备 取蜡样芽孢杆菌［Bacillus cereus CMCC(B)63301］的斜面培养物,接种至上述一瓶培养基内,在25℃摇床培养18小时后，取此培养物接种至其余各瓶培养基内，每瓶接种10mL，同时每瓶加入无菌青霉素4500单位，在25℃摇床培养24小时，再加无菌青霉素2万单位，继续培养24小时，再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,离心沉淀菌体，调pH值至约8.5,用滤柱滤过除菌，滤液用无菌操作调pH值至近中性后，分装于适宜容器内，在10℃以下贮存。青霉素活性测定 选用754紫外光度仪中时间扫描程序，检测波长232 nm； 37 ℃恒温；检测池加入各种溶液的体积总和为3 mL（3×10-2 mol.L-1青霉素G溶液0.1 mL， 待测青霉素酶液0.01 mL，pH 7.0磷酸缓冲液2.89 mL）。混合后立即进行测定，可得到青霉素G被青霉素酶水解的动力学谱图和变化速率。通过对水解前后该波长下吸光度变化的测定，可得到吸光度变化与青霉素G浓度变化间的相关参数，最后测得青霉素酶活性，以国际单位计(μmol.μL-1.min-1)。 2.2.1.2 筛选
进行浓度梯度平板筛选：设定青霉素单位浓度分别为：150单位/mL、200单位/mL、250单位/mL、300单位/mL、350单位/mL、400单位/mL。
因为青霉素在溶于水后分解速率加快，而且随温度的升高其分解速率越来越快，从而使青霉素诱导失去作用。所以要在培养基灭菌后，在培养基还未凝固时加入溶解好的青霉素溶液。
取400单位/mL的培养基上的两个菌落转接于十支试管斜面内，进行传代培养，同时检测其产酶效率。
通过检测发现经过3到4代的传代，其产酶效率有所下降，怀疑是由菌种退化造成的，所以在传代培养基内加入青霉素以保持菌活性。
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2.2.1.3 再次筛选
再次进行浓度梯度筛选：设定青霉素单位浓度分别为：300单位/mL、400单位/mL、500单位/mL、600单位/mL。
重复以上实验过程，最终将青霉素单位浓度提升到1200单位/mL。
2.2.2 菌种生长曲线的测定： 2.2.2.1 标记
取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间。即0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，28h，32h，36h，40h，44h。 2.2.2.2 接种
分别用5mL无菌吸管吸取2.5mL蜡样芽孢杆菌培养液（培养18h左右）转入盛有60mL肉汤培养基的三角瓶内，混匀后分别取5mL混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。 2.2.2.3 培养
将已接种的试管置摇床37℃震荡培养(震荡频率250r/min),分别培养0h,4h,8h,12h,16h,20h,24h,28h,32h,36h,40h和44h，将标有相应时间的试管取出，立即放入冰箱中贮藏，最后一同比浊测定光密度值。 2.2.2.4 比浊测定
用接种的肉汤培养基作空白对照,选用600波长进行光电比浊测定,测得的OD值。 2.2.3 pH对青霉素酶活力影响
按分光光度法测定，恒温37 ℃，改变磷酸盐缓冲液（PBS）的pH，分别测定不同pH下，青霉素酶对青霉素G的水解速率。 2.2.4 温度对青霉素酶活性的影响
按分光光度法，磷酸盐缓冲液的pH为7.0条件下，改变反应系统的温度，测定青霉素酶对青霉素G的水解活性。 2.2.5 梯度平板筛选中的镜检观察 2.2.5.1 镜检准备
在载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环挑取少量菌体涂于蒸馏水上，用酒精灯加热固定。
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2.2.5.2 显微观察
用美蓝染色1到2分钟，用水冲洗干净，烤干，置于显微镜上观察。 3 结果与分析
3.1 通过筛选获得的结果
第一次接种后放入28℃培养箱内培养，24小时后，观察各个浓度的培养基菌落数，如
下表1
表1 不同青霉素浓度下平板菌落的生长情况
青霉素浓度 菌落数
150单位/mL 大于1000
200单位/mL 250单位/mL 300单位/mL 350单位/mL 400单位/mL 大于1000
287
101
29
2
通过筛选获得的在1200单位/mL的菌株，其酶活提高了1.2倍。而酶的稳定性也有一定的提高。
在筛选过程中当降低放入青霉素时培养基的温度，当培养基温度在50到55℃时加入青霉素，进行如下表2梯度筛选：
表2 梯度筛选平板菌落的生长12小时的情况
青霉素浓度 500单位/mL 550单位/mL 600单位/mL 650单位/mL 700单位/mL 750单位/mL 菌落数
27
5
0
0
0
0
筛选获得的高产菌株最高只能在浓度为550单位/mL生长。且连续培养4天后，在600单位/mL的培养基上虽然没有大的菌落长出，但平板周围则有一些密密麻麻小的菌落出现，经过分析认为平板周围出现的小菌落可能是由于接触空气青霉素分解达的快造成的，也就是说边缘的培养基里的青霉素浓度下降的快，这使边缘的菌落容易长出，而中央的培养基由于青霉素分解的慢，使菌很难长出来。
经过再次试验发现当培养基温度在50到55℃时，青霉素的分解速率明显减慢，使得浓度梯度筛选的单位浓度下降，但产酶效率却有一定提高，再次进行梯度浓度筛选，筛选浓度与结果如下：
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表3 高浓度梯度筛选平板菌落的生长12小时的情况
青霉素浓度 550单位/mL 600单位/mL 650单位/mL 700单位/mL 750单位/mL 800单位/mL 菌落数
35
17
15
6
0
0
从650单位/mL和700单位/mL培养基平板选取的菌落，虽然产酶效率提高不明显，但酶的稳定性有显著提高。 3.2 生长曲线的测定结果
通过对蜡样芽孢杆菌［Bacillus cereus CMCC(B)63301］生长曲线的测定，结果如下：
2吸光度1.510.5001020时间/小时
图1 菌种生长曲线
3040其生长对数期为15到18小时，从而可以获得在液体培养中最佳的接种时间。通过验证药典上的方法为最佳方法。 3.3 温度对青霉素酶的活性影响
不同温度下蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63301产生的青霉素酶对青霉素G的水解速率分别为0.0800(25 ℃)、0.0927(30 ℃)、0.1151(37 ℃)、0.1189(40 ℃)、0.1271(45 ℃)、0.1373(50 ℃)、0.1506(55 ℃)、0.1467(60 ℃)、0.1386(65 ℃)μmol.μL-1.min-1。55 ℃时对青霉素G呈现最高水解活性，随着温度的升高或降低，酶水解活性逐渐下降。
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0.160.140.120.10.080.060.040.0202530374045温度 ℃50556065酶活力图2 温度对酶活力的影响
3.4 PH值对青霉素酶的活性影响
不同pH条件下，蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63301产生的青霉素酶对青霉素G的水解速率分别为0.1065(pH 3.0)、0.1089(pH 4.0)、0.1075(pH 5.0)、0.1151(pH 6.0)、0.0861(pH 7.0)和0.0429(pH 8.0)μmol.μL-1.min-1。当PH值为6.0时，酶的活性为最大值。但通常测定酶活时缓冲溶液PH值为7.0，因为酶在PH值为7.0时，其稳定性最高。
0.140.120.1酶活力0.080.060.040.020345PH值678图3 PH值对酶活力的影响
3.5 察蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63301在筛选培养基的生长情况
原始菌种12小时显微观察：菌体呈细丝状，菌体头相接，呈菌丝状，暂无芽孢产生。培养24小时：菌体呈长杆状，菌体相互分散，有极少量芽孢产生。培养36小时：菌体呈短杆状，菌体相互分散，有大量芽孢产生。
第四次筛选600单位/mL平板菌落菌体显微观察：12小时，菌体呈长杆状，菌体相互分散，有少量芽孢产生；18小时，菌体呈短杆状，菌体相互分散，有大量芽孢产生。
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经过筛选后，菌体生长速度明显变快，同时进行菌体的液体发酵发现其酶活也有明显提高。 4 讨论
4.1 关于培养基中蛋白胨和酵母浸膏的一些问题
在青霉素酶发酵方法筛选实验中，发现蛋白胨对发酵液酶活性影响很大，相差近1倍；因此在酶液制备中，保证充分的营养成分至关重要。在我们对发酵方法进行摸索时，还体会到保证必要的摇床转速对最终的酶活力也有重要的影响。总的来说，影响酶发酵的因素比较多，严格按药典操作，并尽量使用质量好的培养成分可以获得比较高活性的产物。同时我们在第一次做液体发酵时，没有加入酵母浸膏，但发酵后的结果反而提高了一点。经过再次发酵验证不加酵母浸膏的液体培养基产酶活性持平或略高于加有酵母浸膏的液体培养基。
4.2 培养过程中遇到的杂菌污染问题
我在做传代培养过程中污染杂菌，因为培养基中含有青霉素，所以怀疑为革兰氏阴性菌，加入细菌分裂素后，杂菌依然存在。只有用原始菌种进行再次筛选。
经过研究依然不清楚所染杂菌的种类，这也将成为我今后研究方向之一。 4.3 在筛选过程中菌的变异
在开始时培养菌种的过程中，菌体长出芽孢大约需要36小时，但经过筛选后其生长速度明显变快，在12小时时即有芽孢产生，可以认定菌体发生变异。 4.4 液体发酵过程中PH值和温度对酶活性的
温度对本酶的活性影响很大。55 ℃时对青霉素G呈现最高水解活性，随着温度的升高或降低，酶水解活性逐渐下降。缓冲液pH对酶活性存在一定的影响，最适酸碱度为pH 7.0。在应用本酶进行青霉素制剂无菌检查等应用时，需特别注意测试温度及酸碱度的影响。 4.5 酶液保藏的一些方法和其保藏效果
对于发酵后的青霉素酶，我们对其不同保存方法的效果进行了测定。实验结果显示，采用标准的药典发酵方法，其酶液能够在4 ℃保存6个月以上活性不发生显著改变。与同时采用的加入甘油或增加氯化钠浓度保护酶活性的方法比较，没有显著的不同（表1）。但如果在发酵的酶活性非常高（大于0.100 μmol.μL-1.min-1）时，在4 ℃保存的第一月内，酶活性可有一定的下降（如970411批），之后可以有同样的保存稳定性（表4）。发生此现象的原因可能与高活性下蛋白质分子间的相互作用有关，其机理有待从分子水平上进一
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步探讨。
表4 青霉素酶稳定性(活性单位: μmolμLmin)
.
-1.
-1
保存方式
保存温度 /℃ 室温 4 室温 4 室温 4 室温 4 室温 4 室温 4 室温 4 室温 4
0 0.0481 0.0481 0.0483 0.0483 0.0474 0.0474 0.0457 0.0457 0.0439 0.0439 0.0321 0.0321 0.0215 0.0215 0.0511 0.0511
1
放置时间/月
2 — 0.0547 0.0506 0.0539 0.0537 0.0534 0.0528 0.0522 0.0484 0.0436 0.0385 0.0373 0.0243 0.0250 0.0542 －
3 0.0521 0.0511 0.0518 0.0493 0.0517 0.0538 0.0504 0.0542 0.0455 0.0450 0.0370 0.0366 0.0225 0.0245 0.0499 0.0555
原液
0.0495 0.0456 0.0505 0.0496 0.0464 0.0491 0.0503 0.0481 0.0474 0.0454 0.0378 0.0345 0.0250 0.0240 － －
原液+2%NaCl
原液+5%NaCl
原液+10%NaCl
原液+10%甘油
原液+25%甘油
原液+50%甘油 冷冻干燥
5 结论
5.1 青霉素酶活性测定
通过对蜡样芽孢杆菌［Bacillus cereus CMCC(B)63301］诱变，再对其筛选、纯化，在第二轮次筛选中，在550单位/mL培养基上获得高产菌株，发酵测得其酶活力为0.1253 5.2 蜡样芽孢杆菌［Bacillus cereus CMCC(B)63301］传代培养酶活结果
其酶活稳定性经传代培养验证,10代后酶活力为0.0933(30℃),稳定性提高.说明通过梯度平板筛选可以获得高稳定性菌株.
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【参 考 文 献】
[1] 张凤凯,张 枫.蜡样芽孢杆菌CMCC ( B) 63301 产生青霉素酶的特性及其应用的研究. 药物分析杂志: 1995.158-160
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[7] A. N.格拉泽.二介堂弘(美.微生物生物技术[M].北京:科学出版社.2002.366-375
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致 谢
首先，感谢天津市大康科技股份有限公司赵青锋工程师，本论文是在赵青锋工程师的亲切关怀和悉心指导下完成的。我所做的实验的初期就是由赵工程师提供菌种和技术支持的。由于在实验初期经验不足犯了不少错误，但赵工程师却给予我耐心的指导。
另外，还要感谢童应凯老师、金红老师、韦东胜老师、杨永涛老师和黄亮老师，他们无论在理论还是在实践中，都给予我很大的帮助，使我得到不少提高，这对于我以后的学习和工作都有巨大的帮助，感谢他们细心而又耐心的辅导，本人对此表示由衷的感谢。
最后，还要感谢卢显芝、王玉、黄海东、吴疆等老师，感谢他们在实验过程中给予的大力支持。
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