分析化验 分析规程 工业循环冷却水中异养菌的测定

工业循环冷却水中异养菌的测定

1 适用范围

本规程适用于工业循环冷却水中异养菌的测定，还适用于原水，生活用水及其他水中异养菌的测定。

2 引用标准

GB 603 化学试剂 试验方法所用制剂及制品的制备。

GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法。

3 方法概要

本法采用平皿计数技术在29±1℃培养72h来测定循环水中的异养菌总数。

4 试剂和材料

本试验测定方法中，除特殊规定外，应使用分析纯试剂和符合GB 6682中三级水规格的水。

4.1 牛肉膏(生化试剂)；

4.2 蛋白胨(生化试剂)；

4.3 氯化钠(GB 1266)；

4.4 琼脂(生物试剂)；

4.5 氢氧化钠(40g/L)溶液：称取10g氢氧化钠溶解在一定水中，加水定容到1000mL，搅匀。

4.6 盐酸溶液(1+11)：量取浓盐酸10mL 溶解到110mL 水中，混匀。

4.7 乙醇溶液75%(V/V)：量取394.7mL 95%乙醇溶解到一定量水中，加水稀释到500mL，混匀。

4.8 牛皮纸：

4.9 医用脱脂棉；

4.10 医用脱脂纱布；

5 仪器和设备

5.1 无菌箱(室)或超净工作台；

5.2蒸汽压力灭菌器；

5.3 生化培养箱；

5.4电热干燥箱(温度可控制在60～280±2℃)；

5.5刻度吸管1mL；

5.6 刻度吸管5mL；

5.7刻度吸管50mL；

5.7 磨口锥形瓶100mL；

5.8 容量瓶1000mL；

5.9 培养皿ф90mm；

5.10锥形瓶500mL；

5.11搪瓷量杯1000mL；

5.12取水样瓶500 mL；

6 试验前的准备

6.1 培养基的制备称取下列试剂：牛肉膏 3.0；蛋白胨 10.0g；氯化钠 5.0g；琼脂 15.0g。将上述试剂加水约950mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中，并用热水补充至1000mL。用氢氧化钠溶液(4.5)或盐酸溶液(4.6)调节pH值至7.2±2，并分装在500mL 锥形瓶中，每瓶分装量不超过其总容量的2/3。塞上棉塞，

用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器121±1℃灭菌15min。

6.2 无菌稀释水制备

6.2.1 生理盐水的配制：称取8.50g氯化钠溶解在1000mL 水中，混匀。

6.2.2 将生理盐水(6.2.1)分装在100mL 磨口锥形瓶中，每个锥形瓶塞子和瓶口间插入一小纸片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器121±1℃灭菌15min。

6.3 刻度吸管的灭菌。

6.3.1 将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10～15min，棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。

6.3.2 每支刻度吸管用1条约40～50mm宽的牛皮纸条，以45°左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端用多余的纸条折叠打结，不使散开，标上量度，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于160±2℃灭菌2h。

6.4 培养皿的灭菌将洗净并烘干后的培养皿10个左右叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，置电热干燥箱中，于160±2℃灭菌2h。

6.5取水样瓶的灭菌:将洗净并烘干后的取样瓶,于160±2℃灭菌2h。

7 测定步骤

7.1 样品的采集

7.1.1 打开水阀，用取样瓶取水样。

7.2 无菌箱(室)灭菌把试验所用的无菌稀释水，无菌培养皿、无菌吸管等用品放入无菌箱(室)内，打开紫外线灯灭菌30min。

7.3 水样的稀释和接种

7.3.1 水样(7.1.1)放入灭过菌的无菌箱(室)(7.2)中，立即用75%(V/V)乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手，点燃无菌箱(室)内的酒精灯。7.3.2.～7.3.7的操作应在无菌箱(室)内的火焰区进行。

7.3.2 选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种后平皿上生长的菌落数小于300个。在空白稀释水样瓶(6.2)上标上稀释度数。

7.3.3 用10倍稀释法稀释水样，即用5mL 无菌吸管(6.3)吸取5mL 水样(7.1.1)注入到45mL 空白稀释水中充分摇匀，此时稀释度为10-1。

7.3.4 另取一支5mL 无菌吸管吸取5mL 稀释度为10-1水注入到第二个稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为10-2。依次类推，直至需要的稀释度为止。

7.3.5 将不同稀释度的水样分别接种到无菌培养皿(6.4)中，每个稀释度重复接种3～5皿，每皿接种1mL，接种时左手手撑托住培养皿，大拇指和食指轻轻将培养皿盖提起，使右手中的吸管恰好插入，吸管与培养皿底成45°角相接，移开吸管时吸管不宜再碰到培养皿，接种时间不宜超过4s，每接一个稀释度更换一支无菌吸管。

7.3.6 另取一组培养皿不接水样，作为空白。

7.3.7 将灭过菌的培养基(6.1)冷却至45±1℃，按(7.3.5)掀开培养皿盖，将培养基灌入培养皿内，每皿应灌15～20mL。灌皿时不要使培养基直接灌在水样上，灌皿后要将融化的培养基和皿中水样彻底混合，小心勿使混合液溅到培养皿的边缘。测定一个水样从接种到灌皿不得超过20min。

7.4 培养待培养皿中培养基(7.3.7)固化后，倒置平皿，在生化培养箱中29±1℃培养72h。

8 计数与报告

8.1 培养之后，取出培养皿，若空白培养皿出现菌落，表明测定过程中有污染，本次测定无效。

8.2 选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，立即进行计数，求得平均菌落数，并修约成二位有效数字(见表例1)。

8.3 若有二个稀释度，其生长菌落数均在30～300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字(见表例2及例3)。

8.4 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应选择稀释度最高的培养皿计数(见表例4)。

8.5 若所有稀释度的平均菌落数均小30，则应选择稀释最低的培养皿计数(见表例5)。

8.6 若所有稀释度均无菌落生长，则以“小于1乘以最低稀释倍数”报告之(见表例6)。

8.7 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300而另一部分小于30时，则选择最接近30或300的培养皿计数(见表例7)。

8.8 以个/mL 表示循环冷却水中异养菌的数量按下式计算：

XFV

异养菌(个/mL)式中：X—按(8.2)方法计数得出的培养皿上生长的平均菌落数，个，

V—取稀释水样的体积,mL，

F—水样稀释倍数，

9 精密度

9.1 由于微生物能以单独个体，双双成对、链状、成簇或一团团等形式存在，而且没有单独一种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落数可能要低于其正常存在的活细胞的数目。

9.2 标准平皿计数的正确度随着平行样皿的增加而增加，当使用5个平行皿，每皿加1mL 样品时测定结果的置信度为95%。

10 备注

本规程参照GB/T14643.1编制