小鼠胸主动脉壁内弹性纤维和胶原纤维的发育规律

CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY

中国组织化学与细胞化学杂志

Vol.29.No.1February.2020

小鼠胸主动脉壁内弹性纤维和胶原纤维的发育规律

罗华，黄达，蔡维君，罗明英

1#

2#

2

3*

（1湘潭医卫职业技术学院，湘潭 411104； 2中南大学湘雅医学院组织胚胎学系，长沙 410003； 3 昆明医

科大学人体解剖学与组织胚胎学系，昆明 650500）

〔摘要〕目的 明确细胞外基质弹性纤维和胶原纤维在不同年龄阶段鼠主动脉中的表达规律。方法 分别采用Van Gieson染色、弹性蛋白免疫荧光染色和Masson染色，观察小鼠胸主动脉在不同年龄阶段（出生后3天、3月、6月和16月龄）的弹性膜形成、弹性蛋白和胶原纤维的表达变化；采用透射电子显微镜术观察12月和18月龄大鼠腹主动脉细胞外基质弹性纤维和胶原纤维的变化。结果 出生后3天小鼠胸主动脉的弹性纤维没有形成完整的弹性膜，3月已初步形成完整的弹性膜，6月有5~7层弹性膜，16月弹性膜呈片段化；出生后3天弹性蛋白的表达低，3月呈上升趋势，6月最高，16月减少；出生后3天胶原纤维含量少，随着年龄增长，胶原纤维的含量增加。透射电子显微镜技术显示12月大鼠腹主动脉细胞外基质以弹性纤维为主，胶原纤维含量较少；而18月大鼠胶原纤维含量增加。结论 细胞外基质弹性纤维和胶原纤维在不同年龄小鼠主动脉壁内的表达规律不同。

〔关键词〕主动脉；弹性纤维；胶原纤维；弹性蛋白；年龄

〔中图分类号〕R743 〔文献标识码〕A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2020. 01. 006

Developmental pattern of elastic and collagen fibers in the thoracic aorta wall of mice

Luo Hua1#, Huang Da2#, Cai Weijun2, Luo Mingying3*

(1Xiangtan Medicine & Health Vocational College, Xiangtan, 411104; 2Department of Histology & Embryology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha, 410003; 3Department of Anatomy and Histo-Embryology, Kunming Medical

University, Kunming, 650500, China)

〔Abstract〕Objective To figure out the expression pattern of extracellular matrix components, elastic and collagen fibers, in thoracic aorta wall of mice at different ages. Methods Van Gieson staining, elastin immunofluorescence staining and Masson staining were performed for detection of the changes of elastic membrane formation, elastic and collagen fibers expression in the mouse thoracic aorta at different ages (3d, 3m, 6m and 16m after birth). In addition, transmission eletromicroscopy was employed for investigating the changes of extracellular matrix elastic and collagen fibers in the abdominal aorta of 12m-old and 18m-old rats. Results Elastic fibers in the thoracic aorta did not form a complete elastic laminae in 3d old mice after birth, but initially formed a complete one in 3m old mice. In 6m old mice, there were 5-7 layers of elastic laminae, and in 16m old mice, the elastic membrane was fragmented. In 3d old mice after birth, elastin content was low, then increased in 3m old mice, and peaked in 6m old mice, while decreased in 16m old mice. Collagen content was low in 3d old mice after birth, and increased with age. Transmission eletron microscopy showed in the abdomi-nal aorta of 12m old rats, the extracellular matrix contained abundant elastic fibers, but less collagen fibers. However, in 18m old rats collagen fibers were apparently increased. Conclusion The extracellular matrix elastic and collagen fibers in aortic wall of mice have different expression patterns at different ages.

〔Keywords〕Thoracic aorta; elastin fiber; collagen; elastic; age

主动脉是体循环的动脉主干，是机体重要的导

〔收稿日期〕2019-08-10 〔修回日期〕2020-02-09〔基金项目〕国家自然科学基金（81500377）〔作者简介〕罗华，男（1980年），汉族，讲师

黄达，男（1991年），汉族，硕士研究生 #为共同第一作者

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：luomingying0403@163.com

血动脉，在导血的过程中，因接收心脏射出的血液管壁扩张而调节收缩压，因管壁的弹性回缩和平滑肌的收缩而维持舒张压[1,2]。主动脉的这些功能涉及主动脉的力学性能，即顺应性和收缩性[3]。其中，顺应性与血管壁中的细胞外基质构成密切相关，弹性纤维和胶原纤维是最重要的两种细胞外基质纤维成分，分别给大血管壁提供弹性特征和拉伸强度，

第1期罗华等.小鼠胸主动脉壁内弹性纤维和胶原纤维的发育规律 35

共同调节主动脉的顺应性[4,5]。大量研究表明，老化可改变主动脉血管壁的生物力学特征，增加血管僵硬度，减少血管弹性，从而降低血管顺应性[6,7]。因此，研究生长发育和老化过程中细胞外基质弹性纤维和胶原纤维的变化规律，对理解主动脉的正常生理功能和相关动脉疾病有重要的意义。

然而到目前为止，有关主动脉细胞外基质弹性纤维和胶原纤维在出生后早期的表达变化鲜有报道，且在成熟和老化过程中的有关资料也不完全。本实验结合VanGieson染色、弹性蛋白（elastin）的免疫荧光技术和Masson染色，观察弹性纤维及其主要成分弹性蛋白，以及胶原纤维在不同年龄阶段小鼠胸主动脉中的变化情况。另外，利用透射电子显微镜术研究成年和老年大鼠腹主动脉壁细胞外基质纤维成分的变化情况，为探讨细胞外基质纤维成分在调节主动脉功能中的作用提供理论依据。

材料和方法

1 动物和分组

不同年龄正常昆明小鼠和SD大鼠（中南大学湘雅医学院实验动物学部提供），共计36只，雌雄不限。昆明小鼠按年龄分成4组：3天、3个月、6个月和16个月组，SD大鼠按年龄分成2组：12个月和18个月组，每组各6只。经乙醚麻醉处死，备皮后充分暴露皮肤，打开胸腔，在手术显微镜下通过使用消毒过的显微手术器械分离出小鼠胸主动脉和大鼠腹主动脉，将其完整取出，分别放入4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定。

2 VanGison、Masson和免疫荧光染色

三顿冷冻切片机连续切片后贴片（片厚8μm），分成3组。第1组行弹力纤维VanGison染色：将玻片置于高锰酸钾中氧化后用草酸溶液漂白5min，然后入elastin染液1h，盐酸分化后用VanGison染液对比染色1min，最后梯度酒精脱水封片；第2组行Masson染色：将玻片置于Weigert铁苏木素染色液染色5～10min后分化，Masson蓝化液充分返蓝，再用丽春红染色5～10min，磷钼酸溶液和弱酸工作液冲洗后行甲苯胺蓝染色，梯度酒精脱水封片；第3组行elastin和α-SM-actin的双重免疫荧光染色：5% BSA封闭后加入elastin（rabbit, 1:200, Abcam）一抗，湿盒中4℃过夜，然后加入生物素化抗兔的

二抗（1:200, Vector），室温孵育2 h，最后加入链霉亲和素偶联的Cy2（1:500, Biotremd）+ 偶联Cy3的α-SM-actin（1:500, Abcam）孵育50min。防荧光淬灭剂封片，Leica荧光显微镜下拍片。用5% BSA代替一抗作为阴性对照，排除二抗的非特异性染色。3 大鼠腹主动脉细胞外基质纤维成分透射电镜检测

取上述2.5% 戊二醛固定的腹主动脉组织，用磷酸缓冲液浸洗3次，每次15min，置4℃预冷的1%四氯化锇固定2h，磷酸缓冲液浸洗2次，标本经梯度乙醇逐级脱水至环氧丙烷后，用环氧树脂Epon812浸透、包埋制备超薄切片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，透射电镜下观察，拍照。4 定量分析

将Van Gison染色和Masson染色所得的组织切片摄片后，用Image-Pro Plus图像分析软件转为灰度图片后分别测量弹性纤维与胶原纤维的光密度值；将免疫荧光染色所得的组织切片摄片后，用Image-Pro Plus图像分析软件测量弹性蛋白的免疫荧光强度。5 统计学处理

实验数据用均数±标准差表示，资料的统计学分析均采用SPSS17.0 统计软件进行单因素方差One way ANOVA）分析，对各组间均数采用SNK-

q检验进行比较。P<0.05有统计学意义。

结 果

1 小鼠胸主动脉弹性纤维和弹性膜随年龄增加而先升高再下降

采用Van Gieson染色研究小鼠胸主动脉细胞外基质弹性膜和弹性纤维的表达变化。结果显示，出

生后3天时，弹性纤维尚未形成完整的弹性膜；3月时弹性纤维已初步形成完整的弹性膜结构；6月时弹性纤维形成5~7层弹性膜；16月时弹性膜出现片段化的改变（图1）。光密度测量结果显示，16月小鼠胸主动脉弹性纤维的含量较6月减少17.7%（图4A）。

2 小鼠胸主动脉胶原纤维随年龄增加而逐渐升高

采用Masson染色观察小鼠胸主动脉细胞外基质胶原纤维的表达变化，结果显示，出生后3天时，胶原纤维的含量低；3月时胶原纤维在胸主动脉中膜和外膜的表达呈上调趋势；6月时的表达进一步增

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图1不同年龄阶段小鼠胸主动脉弹性纤维和弹性膜的Van Gieson染色。A，3天；B，3个月；C，6个月；D，16个月；A1—D1分别为A—D图的局部放大图像；比例尺，100μm

Fig.1 Van Gieson staining for elastic fibers and laminae in thoracic aorta of the mice at different ages. A, 3d; B, 3m; C, 6m; D, 16 m; A1—D1 are locally magnified images of A—D, respectively; scale bar, 100μm

加；16月时胶原纤维的含量最高（图2）。光密度测量结果显示，16月小鼠胸主动脉胶原纤维的含量较6月增加10.9%（图4B）

3 小鼠胸主动脉弹性蛋白随年龄增加而先升高再下降

对小鼠胸主动脉细胞外基质弹性蛋白进行免疫

荧光染色显示，出生后3天时，弹性蛋白的表达较低；随年龄的增加，3月龄时逐渐增多，6月龄时表达最强，而16月龄时弹性蛋白的表达下降（图3）。其荧光强度的光密度测量结果显示，小鼠胸主动脉6月时细胞外基质中的弹性蛋白在出生后逐渐增加，达高峰，随后逐渐减少（图4C）。

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图2不同年龄段小鼠胸主动脉胶原纤维Masson染色。A，3天；B，3个月；C，6个月；D，16个月；A1—D1分别为A-D图的局部放大图像；比例尺，100μm

Fig. 2 Masson staining for collagen fibers in thoracic aorta of the mice at different ages. A, 3d; B, 3m; C, 6m; D, 16m; A1—D1 are locally magnified images of A-D, respectively; scale bar, 100μm

4 大鼠腹主动脉细胞外基质弹性纤维随年龄增加而减少，胶原纤维随年龄增加而增多

电镜结果显示，12月的成年大鼠腹主动脉平滑肌细胞之间有大量弹性纤维，而胶原纤维含量较少；18月的老年大鼠腹主动脉平滑肌细胞之间弹性纤维减少，胶原纤维增多（图5）。

讨 论

主动脉的顺应性与血管壁的细胞外基质构成密切相关，是调节主动脉功能的重要结构基础，弹性纤维和胶原纤维是构成细胞外基质最主要的纤维成分[8,9]。其中，弹性纤维使血管具有弹性和收缩性，

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图3 不同年龄阶段小鼠胸主动脉elastin和α-SM-actin免疫荧光染色。A—A2，3天；B—B2，3个月；C—C2，6个月；D—D2，16个月；A—D为elastin免疫荧光染色；A1—D1为elastin与α-SM-actin双标；A2—D2分别为A1—D1的局部放大图像；*显示弹性纤维的片段化；绿色荧光，elastin；红色荧光，α-SM-actin；比例尺，50μm

Fig. 3 Dual immunofluorescent staining for elastin and α-SM-actin in the thoracic aorta of the mice at different ages. A—A2, 3d; B—B2, 3m; C—C2, 6m; D—D2, 16m; A—D, staining of elastin; A1—D1, dual immunostaining of elastin and α-SM-actin; A2—D2, locally magnified images of A1—D1, respectively; *, fragmentation of elastic fibers; green, elastin; red, α-SM-actin; scale bar, 50μm

胶原纤维则具有很强的抗拉力作用，对弹性纤维的弹性功能起约束作用，它和弹性纤维一起调节主动脉的顺应性[10,11]。在本实验中我们观察到3天龄小鼠胸主动脉没有形成完整的弹性膜，且胶原纤维含量少，提示出生后3天小鼠胸主动脉的结构尚未发育完善。关于大血管壁细胞外基质表达年龄变化的研究，大都是涉及年轻和老年个体的研究，而在出生后小鼠方面尚未见报道，本实验的结果填补了这方面的空缺。我们在实验中观察到3月龄胸主动脉弹性纤维的含量增加，已初步形成完整的弹性膜，到6月龄时已形成5~7层完整的弹性膜。Karimi等[12]

报道，主动脉的弹性膜是主动脉在心脏舒张期继续推动血液流动的结构基础。因此，年轻和成年小鼠胸主动脉弹性纤维的增多是和其心血管的功能相一致的。弹性纤维由多种成分构成，包括弹性蛋白，微原纤维和糖蛋白，其中弹性蛋白占弹性纤维总量的90%[13]。我们对小鼠胸主动脉进行弹性蛋白的免疫荧光染色，其结果和VanGieson弹性纤维染色是一致的，均显示6月龄成年小鼠胸主动脉弹性蛋白的含量最高，这种表达模式和文献报道类似[14]。

大量的研究表明，老化对血管的结构和功能具有重要的影响。老化可引起主动脉血管壁的直径扩

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图4 不同年龄阶段小鼠胸主动脉弹性纤维（A）和胶原纤维（B）含量以及弹性蛋白荧光强度（C）统计学分析。*0.01Fig.4 The histograms showing the quantitative analysis for contents of elastin (A) and collagen (B) and immunofluorescence intensity of elastin (C) in the thoracic aorta of the mice at different ages. *0.01图5不同年龄大鼠腹主动脉弹性纤维和胶原纤维透射电镜观察。A，12月；B，18月；SM：平滑肌细胞；E，弹性纤维；C，胶原纤维；比例尺，2μm

Fig. 5 Transmission electron microscopic observation for elastic fibers and collagen fibers in the abdominal aorta of the rats at different ages. A, 12m; B, 18m; SM, smooth muscle cells; E, elastic fibers; C, collagen fibers; scale bar, 2μm

张和血管壁厚度增加，增加血管僵硬度，降低血管顺应性[15,16]。老化过程中血管顺应性的改变被证明与弹性纤维含量的下降和胶原纤维含量的增加密切相关，当这些细胞外基质发生变化时，会改变动脉

管壁的力学特征，损害其功能并引发相关的动脉疾病，如动脉粥样硬化等[17,18]。Duca等[19]进一步报道在老化过程中除主动脉弹性成分的数量减少，还会出现因弹性酶活性增加而导致弹性纤维片段化。我

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们在本实验中发现16月龄老年小鼠胸主动脉的胶原纤维含量最高，而弹性蛋白的表达下降，且观察到胸主动脉弹性纤维有片段化改变。上述结果表明由于胶原纤维增加，弹性蛋白减少伴随着弹性纤维结构的片段化，可能是老年个体主动脉顺应性下降的一个重要因素，从而损害了老年主动脉的顺应性。同时，本实验还比较了成年大鼠和老年大鼠腹主动脉的超微结构，观察到成年大鼠腹主动脉细胞外基质以弹性纤维为主，胶原纤维含量较少，而老年鼠动脉胶原纤维含量增加。这一结果间接支持本实验的弹性纤维、胶原纤维的组织学和免疫荧光染色实验数据。本文的结果第一次完整的报道了正常大血管壁细胞外基质，包括弹性纤维，胶原纤维和弹性蛋白在鼠发育、成熟和老化过程中的变化，为探讨细胞外基质在调节主动脉功能中的作用提供了一些形态学依据，有助于我们对动脉疾病转归的认识。

参 考 文 献

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