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香樟SRAP分子标记引物筛选

来源：意榕旅游网

安徽农学通报，AnhuiAgri，Sci，Bull，2019，25（20）

25香樟SRAP分子标记引物筛选

张丽华

韩浩章

王晓立

李素华

王

芳

董

蓉

刘宇

（宿迁学院建筑工程学院，江苏宿迁

223800）

摘要：以香樟嫩叶为试验材料，采用SRAP-PCR分子标记体系对420对引物组合进行了筛选。结果表明：共

选出19对引物组合，扩增出367条带，平均19.3条，范围在15～25条。其中，多态性带230条，平均12.11条，范围在6～17条；多态性的比例62.16%，范围在40%～81%。SRAP-PCR分子标记体系稳定，筛选出的引物组合可用于不同种源香樟遗传多样性及品种鉴定的研究。关键词：香樟；SRAP分子标记；引物筛选中图分类号S79

文献标识码A

文章编号

1007-7731（2019）20-0025-04

ScreeningofCamphorSRAPMolecularMarkerPrimers

ZhangLihuaetal.

（TheconstructionengineeringcollegeofSuqianCollege，Suqian223800，China）

Abstract：Usingcamphorleavesasmaterial，420primercombinationswerescreenedbySRAP-PCRmolecularmarkersystem.Theresultsshowedthat：atotalof19pairsofprimerswereselected，and367bandswereexpanded，withanaverageof19.3andarangeof15～25，ofwhich230polymorphicbelts，anaverageof12.11，arangeof6～andtheselectedprimercombinationcanbeusedforgeneticdiversityandvarietyidentificationofdifferentspeciesofcamphor.

Keywords：Camphor；SRAPmolecularmarker；Primerscreening香樟［Cinnamomumcamphora（L.）Presl］，又名小叶樟、樟、芳樟，为樟科樟属常绿乔木，主要分布于中国长江以南地区，适宜深厚、肥沃的酸性土壤环境和温暖、湿润气候，不耐干旱、贫瘠和盐碱土壤环境，是我国重要的园林绿化树种、林用树种和经济树种。近年来，香樟在我国长江以北地区的栽培面积越来越广，但由于引种地与种源生产地之间的气候和土壤条件差异较大，冬季低温和土壤盐碱环境已成为了限制香樟在我国北方地区引种栽培成功的关键因素，选育抗寒、耐盐碱品种成为了当务之急［1］。目前，关于香樟优良品种选育的研究主要集中在种质资源、田间子代生长特性分析以及优良家系早期筛选等方面［2］，而关于香樟耐盐碱、耐寒品种选育研究则相对较少。香樟的生长发育受环境的影响很大，地理类型较多，实生后代变异程度大［3-4］，形态标记、同功酶和染色体核型分析等传统标记方法很难区分辨别香樟种间或种内关系，而DNA分子标记技术能在基因组水平上探究植物种间及无性系间的遗传变异，不受气候和土壤环境因素的干扰，所得的信息内容丰富，更能体现出植物种内和种间的遗传变异。

相关序列扩增多态性（Sequence-relatedamplified⁃

polymorphism，SRAP）是Li和Quiros［5］开发的分子标记技

［6］

术。在观赏南瓜（Cucurbitamoschata）、野牛草（Buchloe［7］dactyloides）等植物上的研究表明，SRAP比ISSR（Inter-

17，apolymorphicratioof62.16%，andarangeof40～81%.TheSRAP-PCRmolecularmarkersystemisstable，

simpleSequenceRepeat）、SSR（SimpleSequenceRepeat）、RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）等几种分子丰富、引物利用率高、重复性好、费用低等优点［8］。SRAP标记技术已广泛应用于品种鉴定、遗传多样性分析、遗传变异和亲缘关系分析和指纹图谱构建等的研究中［9］。关于香樟植物分子标记方面，宋爱云等［4］于2003年将RAPD分子标记技术应用于鉴定香樟优选株和普通株，吕昕谣等［10］也建立了普陀樟的SRAP反应体系，而关于香樟SRAP分子标记方面的研究尚未见报道。为此，本研究采用课题组成熟的SRAP-PCR反应体系，对420对引物进行了筛选，以期为进一步开展香樟的遗传多样性及相关遗传研究提供技术支撑，也可为香樟基因组分析、分子标记辅助育种等研究奠定基础。

标记表现出更丰富的遗传多样性，具有操作简单、多态性

1.1

材料和方法

试验材料

本试验所选香樟试材共14个样品（表1），

包括浙江、江苏、江西、安徽等地香樟分布地区，于2018年

收稿日期：2019-09-27

项目基金：苏北科技发展计划——科技富民强县项目（BN2016167）；宿迁市重点研发计划（L201702）；宿迁市重点研发计划（S201710）。作者简介：张丽华（1982—），女，江苏盐城人，讲师，研究方向：樟属植物逆境生理。

编号1234567810111213149

表1地区浙江嘉兴浙江杭州千岛湖

浙江海宁浙江金华浙江杭州西湖安徽黄山宏村江西宜丰江苏扬州江苏宿迁江苏无锡寄畅园江苏苏州白塘江苏南京江西吉安江西九江

不同种源的香樟材料

经度E120°49′48\"E119°00′56\"E120°37′06\"E119°39′08\"E117°59′50″E115°03′03″E119°30′50″E118°19′47″E120°16′43″E120°44′35″E118°58′58″E114°58′24″E115°57′44″E120°08′33\"

纬度N30°47′57\"N29°34′50\"N30°30′35\"N29°07′30\"N30°00′21″N28°22′53″N32°24′39″N33°55′56″N31°35′11″N31°20′11″N31°53′34″N27°10′07″N29°33′48″N30°15′36\"

编号Em1Em2Em3Em4Em5Em6Em7Em8Em10Em11Em12Em13Em14Em15Em16Em17Em18Em19Em20Me1Me2Me3Me4Me5Me6Me7Me8Me10Me11Me12Me13Me14Me15Me16Me17Me18Me19Me20Me21Me9Em9

26安徽农学通报，AnhuiAgri，Sci，Bull，2019，25（20）表2

SRAP引物序列组成

引物序列（5′－3′）GACTGCGTACGAATTAACGACTGCGTACGAATTCAAGACTGCGTACGAATTAGCGACTGCGTACGAATTACGGACTGCGTACGAATTGACGACTGCGTACGAATTGCAGACTGCGTACGAATTGGTGACTGCGTACGAATTCCACACTGCGTACGAATTCAGGACTGCGTACGAATTTGCGACTGCGTACGAATTATT参照前人研究公布的引物序列［5-10］，由深圳华大基质科技

GACTGCGTACGAATTAATGACTGCGTACGAATTTGAGACTGCGTACGAATTCGAGACTGCGTACGAATTTCGGACTGCGTACGAATTCTGGACTGCGTACGAATTCATGACTGCGTACGAATTCTCTGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTTCA

GACTGCGTACGAATTCGGTGAGTCCAAACCGGAGCTGAGTCCAAACCGGACATGAGTCCAAACCGGAATTGAGTCCAAACCGGACC

1.21.2.1

试验方法

基因组DNA的提取与检测

采用试剂盒法（购自

原平皓生物技术有限公司）提取香樟基因组DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳测基因组DNA的质量（电泳仪电源为美国BIO-RADPowerpacBasic型，电泳仪为北京君意JY-SPCT型），电泳结束后，在自动凝胶图像分析仪（上海培清

TGAGTCCAAACCGGAGATGAGTCCAAACCGGGATTGAGTCCAAACCGGGCT

TGAGTCCAAACCGGAAC

JS-780R全自动凝胶成像分析仪）上观测，确定DNA纯度

并拍照。用核酸蛋白测定仪（BioPhotometerD30）确定其浓度以及A260/A280的比值，最后将样品DNA质量浓度稀释到50ng/μL，于-80℃保存备用。1.2.2

的Mg，0.2mmol/L的dNTPs，DNA模板60ng，TaqDNA聚合酶1.5U，正反引物0.5μmol/L，10XloadingBuffer2μL，加ddH2O至20μL。1.2.3

PCR反应程序

PCR反应程序为：94℃预变性

TGAGTCCAAACCGGGACTGAGTCCAAACCGGGGTTGAGTCCAAACCGGTGCTGAGTCCAAACCGGTTGTGAGTCCAAACCGGTCATGAGTCCAAACCGGTGTTGAGTCCAAACCGGTCCTGAGTCCAAACCGGTAA

PCR扩增体系SRAP-PCR反应体系为：2.0mmol/L

5min，94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min反应5

TGAGTCCAAACCGGCAGTGAGTCCAAACCGGAAGTGAGTCCAAACCGGCTT

TGAGTCCAAACCGGTAG

个循环，94℃变性1min，51℃复性1min，72℃延伸1min反应35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色后，在可见光灯箱上照相记录。1.2.4

引物筛选

1.3

数据处理与分析对凝胶电泳结果中清晰、易于辨

认的条带根据其有无进行统计，同一位点有带记为“1”，无带记为“0”，建立二元原始数字矩阵，并计算扩增产物的多态位点数和多态性百分率。

的3个香樟材料DNA模板对420对SRAP引物进行筛选，最用于所有DNA样品扩增（表2）。

从供试材料中选取外观形态差异较大

终筛选出清晰度高、稳定性好、多态性丰富的SRAP引物

2.1

结果与分析

香樟DNA的提取检测

通过测定，14份香樟的

DNA样品的A260/A280的值均数在1.7～2.0，经过0.8%（图1）。

3讨论与结论

琼脂糖电泳检测，其条带清晰，符合扩增的基本要求

的，所反映的遗传多态性能直接揭示不同植物基因组DNA间的差异［11］。研究认为，SRAP-PCR试验的结果与温度以及Mg2+、dNTPS、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA这5个因素的浓度有关［12］，不同物种的SRAP-PCR研究影响

SRAP-PCR反应的引物序列和扩增程序都是特定

因素的差别也很大，这可能与不同植物本身的遗传差异有关，也可能与研究者在设定正交设计时不同因素的浓度设定不同有关。此外，不同研究者采用的仪器设备、凝胶的质量和浓度均有差异，可能也是造成SRAP-PCR试验结果存在差异的原因。因此，适宜的SRAP-PCR反应体系必须针对不同植物种类、不同试验条件、不同试验仪器及试剂对主要的影响因素进行优化，以保证试验结果

图1

引物组合（Em19/me16）的垂直电泳结果

的稳定性和可靠性。

以

目前，关于SRAP分子标记引物筛选的研究较多。郭大龙等［8］从100对SRAP引物组合中，筛选出19对能在葡萄中扩增出条带清晰且多态性好的引物组合。安佰义等［12］从176对SRAP引物组合中，筛选出25对适用于白檀的引物组合。李芳芳等［13］从96对SRAP引物组合中，筛选得到18对条带清晰、稳定且多态性丰富的引物作为枫香树基因组的扩增引物组合。本研究中，将20条正向引物和21条反向引物随机组合得到420对引物组合，其中19个组合能在香樟DNA中扩增出清晰明亮的条带。由此可见，SRAP引物组合在不同植物的基因组上具有不同的结合位点及数量，这导致扩增效果及适用引物存在差异。引最优PCR扩增体系，倘若引物的选择没有特异性，往往实验结果并不理想［11］。

在获得最优PCR扩增体系的基础上，本研究对420对引物进行了大量的筛选工作，从中初步筛选出19对引物。通过对这些引物进行SRAP-PCR的多态性数据分析，得出总条带数为367条。其中，多态性条带数达230条，其扩增产物片段大小均在2000bp以内且分布较均匀，多态率为62.16%。这为香樟的遗传多样性研究、品种鉴定、亲缘关系分析、遗传图谱构建等研究奠定了基础。参考文献

［1］韩浩章，王晓立，刘宇，等.香樟黄化病现状分析及其治理研究

［J］.北方园艺，2010（13）：232-235.

［2］张谦，曾令海，蔡燕灵，等.樟树自由授粉家系生长与形质性状的

遗传分析［J］.中南林业科技大学学报，2014，34（1）：1-6.［3］姚小华，任华东，吴柯久，等.樟树苗期遗传变异研究［J］.江西农

业大学学报，1999，21（3）：320-328.

［4］宋爱云，陈辉，董林水.RAPD分子标记在鉴定香樟优选株和普通

株中的应用［J］.应用与环境生物学报，2003，9（3）：263-265.［5］LiG，QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymorphism（SRAP），

AnewmarkersystembasedonasimplePCRreaction：itsapplica⁃tiontomappingandgenetagginginBrassica［J］.下转57页（）

2.2SRAP分子标记引物组合的筛选及多态性分析

14份香樟种源DNA为材料，利用SRAP分子标记体系对选择出清晰且明亮、条带数目多的引物。最终从420对引

420对引物进行筛选，淘汰那些模糊的、条带较少的引物，物组合中选出19对特异性强的引物组合，共获得367条带，平均19.3条，范围在15～25条。其中，多态性带230条，平均12.11条，范围在6～17条；多态性比例为62.16%，范围在40%～81%（表3）。

表3引物组合Em16/me6Em10/me9Em9/me20Em6/me13Em11/me17Em12/me19Em15/me15Em3/me2Em3/me12Em5/me2Em16/me2Em3/me6Em1/me4Em6/me15Em9/me14Em12/me20Em19/me11Em19/me16Em18/me20总计平均范围

SRAP引物组合扩增后的总带数与多态性带数

扩增总带数

（条）

25222619201717202118172216212016171536718

多态性带数（条）

161516101110131712141515131286230999

多态性条带的比例

（%）

64.0068.1861.5452.6355.0052.9458.8265.0080.9566.6782.3568.1856.2571.4365.0075.0047.0640.0050.0062.16

物序列是SRAP-PCR扩增过程成功的关键，即使建立了

15～2519.3

6～1712.11

病虫害的耐药性和免疫力不断增强，使用抗病虫的新品种也达不到理想效果。近年来，危害严重的松毛虫具有爆发的特征，部分区域几乎年年爆发，而作为病虫害防治第1道屏障的监测预报，尚未能及时有效监测。发现病虫害时已经造成不利的影响，再开展防治工作十分困难［8］。因此，迫切需要培育出更强的抗病虫新品种［9］。3.4

潜在风险增加

20世纪90年代末，虽然有多种病虫

害传入凉山烟区，但是仍有部分病虫害得到了有效的控制，并未爆发和造成严重的影响。当前由于外部的大气候和土壤微环境在不断改变，加之病虫害种类较多，受抑制的病虫害仍有可能在未来爆发，潜在风险较大［10］。

和选择科学有效的方法，以达到可持续控制的目标。按照预防为主，标本兼职的原则，严格开展检疫，注重开展监测，以药剂防治为辅助，协调运用人工、物理等方法开展综合防治，如此才能有效的进行烟草病虫害的防治，加快凉山烟草生产质量的系统化提升［14］。

5结语

云烟87在在四川凉山烟区一直有较好的生长和质量

表现，种植好、保护好云烟87品种是烟草发展中的一项重要工作。针对不同的气候和土壤环境开展科学的栽培管理，以维持品种特性。在种植管理中，针对病虫害种类多、发生面积大、潜在风险高的现状，做好监测预报、统防统治、综合治理工作，将云烟87的可持续种植工作做实做细。参考文献

［1］李静.优质烟草栽培技术［J］.江西农业，2016（17）.

［2］张毓.黑龙江省烟草栽培技术［J］.中国林副特产，2010（05）.［3］程谦，徐月东，谢延辉，等.烟草栽培技术的发展现状与趋势［J］.

江西农业，2019（04）.

［4］曾淑华，杨焕文，赵正雄，等.国家级精品课程——烟草栽培学教

学内容和教学方法的改革探索［J］.学习月刊，2010（09）.［5］唐世凯.高等农业院校烟草栽培专业实践教学方法研究［J］.职业

教育研究，2010（08）.

［6］洪其琨《.中国烟草栽培》评介［J］.中国农业科学，1964（09）.［7］张天虎.高质量烟草栽培技术［J］.中国农业信息，2016（21）.［8］孙峰.芒草内生、根际土壤细菌群落分析及其促生特性测定［D］.

南阳：南阳师范学院，2019.

［9］李德祥.农业信息技术在我国烟草栽培管理中的研究与应用现

状［J］.北京农业，2015（09）.

［10］吴绍山.浅谈山区优质烟草栽培与采收烘烤技术［J］.安徽农学

通报（下半月刊），2010（16）.

［11］林颖.水稻根际土壤铁还原微生物的丰度及多样性变化特征

［D］.西安：西北农林科技大学，2019.

［12］林玥.保护性耕作对大豆田土壤养分及其根瘤菌群落多样性影

响的研究［D］.西安：西北农林科技大学，2019.

［13］杜高峰.白芨快繁体系建立及不同地区根际土壤微生物研究

［D］.合肥：安徽农业大学，2018.

［14］崔尹赡.三七根际土壤细菌的群落结构与功能研究［D］.昆明：

昆明理工大学，2017.

4防病减害的措施

4.1

做好病虫害预报工作

结合所在区域的气候和土壤

情况，通过多种有效的手段来监测病虫害的发生，预先判断病虫害的发生动态和程度，提示生产者做好防治准备。病虫害预报对于重心前移、加强病虫害防治有十分重要的作用。因此，要组建群众性的预测网，开展群体预防

［11］

。

以烟为主统防统治

防治病虫害要注重以烟为主，

4.2

既要选择抗病虫强的良好品种，又要通过有效的生产管理，提高烟草自身的免疫素质，调动开启烟草自身的保护功能，打好预防病虫害的内在基础。在烟草病虫害的防治中，也要高度重视邻近其它作物的病虫害防治，两者不能分开，否则虫害迁飞、带病传播，仍会导致病虫害的蔓延，因此统防统治是开展防治的重要环节之一［12］。4.3

协调化防和生防的矛盾

化学防治和生物防治各有

特点和优势，二者要进行有机结合、有效协调、互相补充，发挥最大的效能。在当前重视环保、注重生态友好的大形势下，要以生物防治作为主要的措施，可采用芽茧蜂、益鸟等多种渠道的生物防治。化学防治是传统方式，属于关键的急救措施，必要时需选择合理的药物和施用时间，只杀灭病虫害，减少对其天敌的影响［13］。4.4

因地制宜引进和选择防治方法

在开展烟草病虫害

的防治过程中，面对各地不同防治措施，要始终有“适合才最优”的思想，因地制宜，从保护生态环境的角度引进

2001（103）：455-461.（上接27页）TheorApplGenet.，

（责编：杨

变异和亲缘关系［J］.林业科学研究，2019，32（3）：88-96.

林）

［6］FerriolM，PicB，NuezF.Geneticdiversityofagermplasmcollec⁃

tionofCucurbitapepousingSRAPandAFLPmarkers［J］.Theor［7］BudakH，ShearmanRC，ParmaksizI，etal.Molecularcharacter⁃

izationofBuffalograssgermplasmusingsequence-relatedampli⁃328-334.

fiedpolymorphismmarkers［J］.TheorApplGenet.，2004（108）：［8］郭大龙，张君玉，李猛，等.葡萄SRAP反应体系优化及引物筛选

［J］.基因组学与应用生物学，2010，29（2）：379-384.

［9］郭丽琴，李友丽，饶国栋，等.利用SRAP分子标记分析杨属遗传

ApplGenet.，2003（107）：271-282.

［10］吕昕谣，赵颖，赵国淼，等.普陀樟SRAP-PCR反应体系的建立

［J］.浙江林业科技，2014，34（3）：23-27.

［11］ZhuS.，LiuT.，TangQ.，etal.Evaluationofbamboogeneticdiver⁃

sityusingmorphologicalandSRAPanalyses［J］.Genetika，2014，［12］安佰义，于慧颖，吴双，等.白檀SRAP-PCR体系优化及引物筛

选［J］.北方园艺，2018，24：15-20.

［13］李芳芳，杨少宗，柳新红，等.枫香树DNA提取及SRAP-PCR反应

体系的建立与优化［J］.河南农业大学学报，2015，49（1）：46-52.50（3）：306-313.

（责编：张宏民）

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