激活型人源化抗人CD137单克隆抗体的研制与生物学活性鉴定

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激活型人源化抗人CD137单克隆抗体的研制与生物学活性鉴定

何妍w，王华菁w，陆婷\\徐依云\\黄勇\\杨焕凤1

摘要目的制备鼠抗人CD137抗体，并对该抗体进行人

Bcl-xL)来增强细胞存活，CD137通过刺激抗体依赖

hCD137>CDNA3.4真核表达质粒， 经293F细胞表达纯化及鉴定后，获得CD137蛋白。制备 pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen>CD137 的慢病毒，感染 HEK-293FT细胞，获得用来筛选杂交瘤的CD137转基因细 源化改造。方法构建

性细胞介导的细胞毒性（ADCC)增强NK细胞的增

殖。CD137对肿瘤反应性T细胞存在优先表达及 增加T细胞募集到肿瘤部位的能力，可以保护T细 胞株。将CD137蛋白免疫小鼠，检测小鼠血清抗体效价，将 免疫小鼠的脾脏和骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用ELISA方法

及流式细胞术对小鼠杂交瘤进行筛选。将筛选后的杂交瘤 细胞接种小鼠，获得腹水。对抗体亚型和抗体效价进行测 定，并通过竞争结合抑制实验等方法对所获的CD137单抗 的生物学特性进行分析鉴定。提取该mAb杂交瘤细胞株的 总RNA逆转录成cDNA，进行鼠抗人CD137抗体可变区序 列克隆，HEK构建人源化抗体重链和轻链表达载体，瞬时转染 -293FT，检测分析各重组人源化抗体与抗原的亲和力。 结果获得1株CD137单抗（6F5)，该抗体与CD137L有竞 争作用。蛋白结合表位在A. A 30-100。6F5能够激活FF- kB信号通路，对外周血单个核细胞增殖具有显著促进作用，

且人源化后抗体的亲和力不变。结CD论成功制备1株 137人源化抗体，该人源化抗体为下一步开展体内肿瘤治

基

。

关键词CD137;单克隆抗体;T细胞激活 中图分类号R819

文献标志码A文章编号1000 -1492(2018)09 -1332 -06

doi：10. 19405/j. cnki. issn1000 - 1492. 2018. 09. 003

CD137 ( CD137/TNFRSF9)可能是第一个被确

定为免疫治疗靶标的TNFRSF成员[1-*2 ]。CD137由

调节性T细胞(Treg)和几种先天免疫细胞群体组成 型表达[3]，CD137抗体通过三聚体连接人肿瘤坏死 因子受体相关因子1 (TRAF1)和人肿瘤坏死因子受 体相关因子2(TRAF2)，调节免疫细胞功能通路NF- kB的活化(4)，能诱导干扰素>(IFN>)和白介素2 的增殖和产生，并通过上调抗细胞凋亡途径（包括2018 -05 -16 接收

基金项目：国家自然科学基金（编号:31500755)作者单位：1治疗性疫苗国家工程中心，上海

201203

2复旦大学生命科学学院，上海2004333第二军医大学肿瘤研究所，上海200433

作者简介:何妍，女，硕士研究生；

杨焕凤，女，MBA，副高级工程师，责任作者，E-mail: heyan

@ canatiare. com

胞免受活化诱导的细胞死[SR(ac/via/on-in- duced cell death，AICD)，同时增强T细胞的毒活

性[5]，然而，目前已研发的CD137抗体对于CD137 蛋白的特异性识别结合能力有限，对NF-B信号通 路的激活能力有限，促进PBMC细胞增殖有限，或诱 导免疫细胞分泌细胞因子的能力有限，因此亟待开 发新的人源化CD137抗体以用于新药研发。1材料与方法

1.1

试剂与材料

1.1.1 试剂 PCRbuffer、dNTP、rTaqDNA 聚合酶、 DL2000和DL 15000 DNAMarkei•、性核酸内切 酶均购自日本TaKaRa公司；DNA片段回收试剂盒 和质粒小提试剂盒，蛋白Markei•均购自北京天根公 司；Gibson Asse、bly Master Mix 购自美国 NEB 公司； 完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、Acu/in管均购自 美国 Sigma 公司；脱脂奶粉、PE-Mouse anti-hCD137 抗体购自美国BD公司；Lipofectamine 2000转染试 剂、RPMI 10和DMEM培养基、GIBC0胎牛血清 (FBS)均购自美国 ThermoFsher Scientific 公司； HRP标记山羊抗小鼠IgG、goat anti-mouse-7均购

自美国Abeam公司；Protein A纯化柱购自美国GE 公司。

1.1.2菌种与质粒真核表达载体PCDNA3. 4由 该治疗性疫苗研究中心实验室保存；大肠杆菌 DH5a感受态及大肠杆菌BL21购自北京天根公司。 1.1.3细胞与病毒小鼠骨髓瘤细胞SP2/0购自 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，人胚胎 肾细胞293F为治疗性疫苗研究中心实验室保存。 PBMC细胞来自于志愿者，标本获取与使用方法得

到上海长征医院医学伦理委员会的批准。

1.1.4 实验动物与组织来源 SPF级6~8周龄 Balb/c、F1小鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物 有限公司，该实验对动物的处置均符合动物伦理学

安徽医科大学学报\"'01 2018

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• 1333 +

标准。由复旦大学实验动物中心协助饲养。

1.2方法

1.2.1 蛋白真核表达质粒的构建与鉴定通过 DNA/ai•软件比较人CD137胞外段的亲水性与免疫 原性，选取CD137第86 ~ 186个氨基酸所在的胞外 段作为免疫靶向片段，并设计成在重组肽段羧基端 (c端)融合有一个H2标签的形式。随后，将以上 所对应的基因片段：端添加Hindlll酶切位点、3^端 添加XKal酶切位点后交由上海桑尼生物公司合成， 通过酶切位点Hindlll和Xbal将该基因片段插入 ZsG/en病毒包装载体上，并感染293FT细胞通过

流式分选培养制成稳定表达细胞株，将细胞株结合

纯化的抗体，无突变的CD137转基因细胞株做为阳 性对照，通过流式检测法中阳性比例确定表位。

表

1 CD137人至犬序列突变体表

HCD137胞外结构域的突变体氨基酸改变Hu CD137 N&EN30K，A56T，G57S，R60K，T61AHu CD137 N&E 1N30K，D38G，N39K，R41K，S46L， A56T，

G57S，R60K，T61AHu CD137 N&E 2N30K，A56T，G57S，R60K，T61A， K69E，+CDNA3.4载体中，构建CD137真核表达质粒 +CDN3. 4,转化大肠杆菌DH5a感受态，通过Hindl- II/Xbal双酶切和PCR鉴定（上游引物P1:5〇 CCCAAGCTTATGGGAAACAGCTGTTAC-3’；下游引

p2: 5,-(；CTCTAGATCAATGGTGATGGTGATGAT- GCTGCGGAGAGTGT-3 ’筛选阳性克隆后由上海桑

尼生物公司测序。

1.2.2重组蛋白的表达与纯化运用脂质体转染 法将构建成功的pCDNA3.4/hCD137-his重组载体 转染293F细胞。取对数生长期293F细胞，于37 °C、120 r/min的C〇2细胞摇床中培养，培养密度为 1.0x105/ml，细胞生长密度达到倍数增殖时，进行 转染;将脂质体-载体混合液加入细胞，扩大培养7 d后收集上清液进行纯化，其对照为转染+D- NA3. 4-GFP 空载体的 293F 细胞（293/m〇ck)。

1.2.3鼠抗人CD137单克隆抗备将纯化的

重组蛋白人CD137与等体积的弗氏佐剂混合乳化 均勻（初免使用完全弗氏佐剂，加强免疫使用不完 全弗氏佐剂），随后对3只Balb/c雌鼠经皮下多点 注射免疫，免疫剂量为100 \"g/只，体积为300 \"7 只，共免疫3次，时间间隔为2周。初免后每2周从 小鼠尾静脉采血，在第3次免疫完成后进行一次腹 腔冲击免疫，免疫剂量为50 \"//只，3 d后取该小鼠 脾细胞与SP2/0细胞做融合实验;HAT法筛选10 d 后换HT培养基。在第14天时吸取杂14交瘤细胞 培养上清液进行人CD137包被的ELISA检测，对检 测结果为阳性的亚克隆采用有限稀释法进行至少2 次以上的克隆化，直到筛选出稳定分泌单克隆抗体 的融合 。

1.2.4表位鉴定为了确定CD137蛋白抗体的表 位结合区，在公开的犬CD137蛋白序列（R3 Seq. XM 845243)上对人CD137蛋白（4-1BB蛋白）的胞 外结构域进行一系列突变。具体的突变位点参见表 1，将突变后的序列构建到pHAGE-CMV-MCS-IRES-

R75K，E77VHu CD137 N&E 3N30K，D38G，N39K，R41K，S46L， A56T，G57S，R60K，T61AHu CD137 N&E 4

L24I，P27S，N30K，D38G，N39K，R41K， N42S，S46L，A56T，G57S，R60K，T61A，， K69E，R75K，E77V，TI，P90S，S100Hu CD137 N&E 5

K115Q，a21R，R134Q，R1S，V156AHu CD137 N&E 6

S161A，P162S，D1G，L165F，A169T

1. 2. 5人源化抗体的制备使用TRIz〇L(购自上

海生工生物）提取杂交瘤细胞株的总RNA，用逆转 录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，以cDNA为模 板做PCR，使用I/-P/mer Sets试剂盒分别克隆抗体 重链和轻链可变区序列；将克隆得到的抗体重链和 轻链可变区序列测序。将PCR产物克隆入+CD- NA3. 4载体进一步扩增表达。构建嵌合抗体，将上

述测序正确的质粒构建成真核表达载体pcDNA3. 4 (+)(VHCH)和（VLCL)。将重、轻链表达载体后 共同瞬时转染293F细胞表达抗体蛋白。在37 C、 5%C〇2的摇床中培养7 d后收集上清液，用琼脂糖 凝胶protein A层析填料纯化上清液中的嵌合抗体。人源化过程根据以下原则进行:在比对鼠源抗 体与胚系模板的基础上，完全保留CDR区的氨基酸 序列，参考已有文献报道的关键性骨架区残基，以及 已上市/临床的基于IGKV4-1 # 01的人源化抗体确 定人源化序列，对骨架区的关键鼠氨基酸进行选择 性保留，产生初步人源化序列，之后再根据突变对亲 和力的影响逐渐减少骨架区鼠氨基酸数。共有四个 突变体，c6F5为人鼠嵌合抗体，c6F5-IgG2为鼠可变 区构建在人的IgG2骨架上，C6F5-HR1为可变区保 留一个鼠源氨基酸，发现表达量下降后将影响的氨 基酸序列回复突变为hu6F5 A/Vback人源化抗体。

全基因合成人源化抗体hc6F5重链可变区和轻 链可变区，将抗体重链可变区和轻链可变区分别插 人 pcDNA3.4 ( t )-sshkappa 和 pcDNA3.4 ( + )- sshIgG2表达载体，将重、轻链表达载体后共同瞬时

• 1334 •安徽医科大学学报\"$

Universitatis Medicinalis Anhui

2018

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转染293F细胞表达抗体蛋白。在3< W、5UCO!的

培养tein A 层析填料纯化上清液中 的人源化抗体 hu6F5。 1.2.6抗体体外功能鉴定

1.2. 6.1 FF>B信号通路检测制备表达人CD137以及稳定整合的FF>B 素酶 基因的293R

。收

，洗及重悬

DMEM

浓度，抗抗 合 和，然后求出抗 和

50U 合的抗体浓度。 亲和常数，画出饱和 ，EC50 亲和常数。1.3统计学处理采用SPSS 16.0 ，

表示，

间

采用：分

(ANOVA)， 间 采用t检验，以！<0.05

学义。

2

完全培养基， 6 x 105个/ml。将50 \"细

铺板于白色96 板的 测 。字2.5：1 的交联抗体F6山羊抗人IgG Fc的结果

2.1真核表达质粒的构建与鉴定将+CDNA3.4

下，分另加入human IgG2 (同型对照）以及各抗体。 加入抗体后将平板在3< W温育5 h。加入<5 \"的 Bright-Glo Luciferase试剂，使用酶标仪测 素酶活性的量。1.2. 6. 2人源化CD13<抗体诱导细胞因子表达用不同浓 源化CD137抗、抗CD3-克隆 UCHT1以及UTOMILUMAB (作为阳性对照）、cG33- IgG2(作 性对照）刺

血单个核 （PB-MC)。

后检测培养上 。通 ELISA法检测上

的 子。 样品和 加入到抗 子包被的96 板

。 温放置2 h后，

PBS-T中洗板3次，先与作检测抗

温，然后

加入底物。450 nm

测

，基

算浓度。

1.2.7抗体亲和力鉴定

1.2. 7.1 BLI检测抗体亲和力结合人CD137的某些抗体的结合动力学使用Fortebio octet 384仪器 通过生物膜干涉（BLI)技术测量。包含氨基酸24- 186的 CD137/his彳 蛋白由本研究室制备。将蛋白质溶解于含PBS、0. 1U 血清白蛋白 (BSA)及0. 02U Tween 20的缓冲液中。抗体通过 与AMQ传感器固定，在PBS、0. 1U BSA及0. 02U Tween 20中将抗体浓度稀释为50 nmol/L，将重组蛋 白人CD137在1. 56 ~ 100 nmol/L浓度范围以1 500 r/min结合10 min，随后以相同转速在PBS、0. 1U BSA及0. 02U Tween 20中进行10 min解离。结合 的复合物通过甘氨酸脉冲再生。使用octet Data A­nalysis 9. 0

。

合简便

的1 : 1 Langmuir结合模型。抗 出与[人

CD13<的可逆结合。

1.2. 7. 2 FACS检测抗体亲和力3倍稀释不同人

源化抗体，加入到CD137-293 ，再用AlexaFluor® 7-GOATAnti-Human Ab 染色后上流式细胞仪检测荧光。当抗原为一

，逐渐增加抗体

真核 和合成的人CD137 基因片段

HindllI/Xbal双酶切处理， 回收后在T4接酶作用下

接， 至大 DH5-质粒。 质， 经HindI-

Il/xbal双酶切和PCR方式鉴定均可获得约558 bp

的阳性 （图1A)，由上海

生物公司测

序。经

，真核

质粒+CDNA3.4-CD137

。

2.2重组蛋白的表达纯化与鉴定以293F 和 293F/mock为对，用ELISA方法检测其上 中hCD137蛋白的表达。结果显示，293F、293F/mock 上清液中 hCD137 的 性，293F/hCD137-His基 染细胞上 hCD137 ，表达的目的蛋白能够

型

。SDS-PAGE

1B。

66.2

94.4

45.045.033.031.0

26.0

20.0

21.514.0

14.4

6.50

图1

CD137表达载体、重组蛋白及CD137单抗6F5的鉴定A: h-CD137基因的克隆和+CDNA3. 4重组载体的酶切验证;B: h-CD137-his融合蛋白的蛋白纯化及Western blot验证；C: h-CD137 单抗6F5的蛋白纯化

2.3 CD137抗体的表位测定将突变后的

序列构建到 pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen 病毒 装 上， 染293FT细胞通过流 选培制成稳定表达细胞株，将细胞株结合6F5纯化抗体， 无突变的CD137转基 性对照，通

流 测法中阳性比例确 位，

2。|

位在a. a. 30 ~ 100之间。

安

表2

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Sep & 5& ( 9 )

• 1335 +

抗体6F5表位图

A 5 000「

4 000-f3 000-兹

样本______NSE

6F5

阳性对照

-+

NSE1 NSE 2 NSE 3 NSE 4 NSE5 NSE6

-- + - + +

+ + + + - +

2.4人源化抗人CD137抗体的信号通路检测使用Bright-Glo Luciferase检测试剂盒检测加入抗体后 反应5 h的CD137转基 内 素酶的表达

情况，读值见图2。由图可见6F5能够激活NFKB信 号通路，并产生 与阴性

素酶

产生 （！<0.01)。

，该值

2 000-

1000

-

i

1 2

图2

3 4 5 6 7

抗体浓度10 nmol/L

NF-kB信号通路的检测

1: m6F5 &2 : c6F5 &3 : c6F5-IgG2 &4 : c6F5-HR1 &5 : hu6F5-A/V back & 6 :UTOMILUMAB &7: Cg33-IgG2 & 与 Cg33-IgG2 组相比：<0. 01

PBMC的影响

A: PBMC与SEA及CD137抗体共培养4 d后的IL-2含量& B: PBMC与CD3抗体及CD137抗体共培养4 d后的IFN-含量；与 Cg33-IgG2 组相比：###!<0• 001& 与 PBMC 组相比：##!<0.01&1: m6F5 & 2: 1F5 & 3 : 1F5-IgG2 & 4 : 1F5-HR1 & 5 : hu6F5-A/V back & 6 : UTOMILUMAB；7；Cg33-IgG2 ；8. PBMCL)，检测6F5抗体及其他不同人源化抗体与CD137

图&人源化抗人CD137对

2.5

浓 抗体对PBMC细胞激活功能的鉴定用不同源化后不同突变hCD137抗和抗CD3-克

蛋白的亲和力（图4A)。

基酸

下降(表3)。

源抗体亲和

隆UCHT1刺激PBMC，使用试剂盒检测培养上清液

的 IL-2( 3A)、IFN-含量（图 3B)。

hCD137抗 PBMC 培

抗原抗体反应 的 直接定

价抗体亲和力大小。hCD137-293T应用 析抗体亲和力，抗的EC50 gEC5〇 源抗体的亲和

(图 4B)。3

讨论肿瘤微环

含CD137，

位置由效

(6)。更 的是，必

至肿瘤，以。 抗体的L〇-下降，同BLI数据

子的 子含

，与正常

上

性。

2.6抗体亲和力分析分别使用BLI和FACS的法检测人源化后 抗体的亲和力。生膜

层光学干涉技术（Biolayerlnterferometry，BLI)是通 过固化CD137单抗6F5，结合CD137蛋白（结合浓

次为 100、50、25、12. 5、6. 25、3. 12、1. 56 nmol/

应子和 性T

须将CD137激动剂

体kd值

3

组别

UTOMILUMABc6F5

c6F5-HFR1c6F5-IgG2hu6F5-AVBACK

KD (M)308E -113.34E -10709E -108.80E-104.69E -10KDError1 19E -112.20E -11307E -11405E -113.59E -11kon(1/Ms)8.07E+055.46E+053.02E+053.20E+052.78E+05kon Error7. 10E +035.83E+033.08E +033.66E+032.52E +03kdis(1/s)3.05E -051.83E-042.41E -042.82E-041.31E -04kdis Error9.57E-061.18E-051.11E-051.26E-059.91E-06Full RV0.993 60.991 90.994 70.993 10.996 3

• 1336 +安徽医科大学学报\"'01 2018

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Cycle:3

Cycle:2

UTOMILUMABc6F5c6F5-IgG2■ UTOMILUMAB

Chimeric-6F5L6-6F5■ HKR1-6F5 • A/Vback-6F5

120 000

^ 80 000

袅 40 000

C6F5-HR1

图4

hu6F5-A/V back

抗体亲和力定量分析结果

抗体浓度(nm〇l/L)

1 10

A:BLI测定不同CD137单抗的亲和力&B:FACS测定不同CD137抗体亲和力

最大 毒性（例如 和骨髓中）。I

实上，大 的CD137仅 瘤微环境[7]。 是些信号机制由TNFR家族和其他的其他 [8]， 可会有脱作用。总的说，基 CD137的 可 和转化发展提供 的CD137 源抗 人源化抗体已经 源化抗体的表位和 会 药物毒性。下一步研究 是

会，

切

。目前

临性的

及亲和力。该

CD137抗 位 ，可

源化抗

内实

上抗肿瘤效果，建立抗体药 内外药效学评价

，并且可 展联合用药评价体内外药效学。

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tory T cells by 0X40 and CD137 [ J ]. Cytokine Growtli Factor

2008，19:253 -62.Rev，

Preparation and biological acti1^^;^ of humanized monoclonal

antibody against human CD137

C National Engineering Center for the Treatment of Vaccines，Shanghai 201203 ; 2University，Shanghai 200433 & 3 Cancer Institute，The Second Militarf Medical University，Shanghai

Abstract

He Yan1，2，Wang Huajing1，3，Lu Ting1，et al

200433 )

The

Objective

To prepare mouse anti-liuman CD137 antil3〇dy and humanize this antil3〇dy.

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布地奈德干预对哮喘小鼠NF!B/TGF-pl通路

及早期气道重塑的影响

邓鹏辉1\"马常亭2\"3\"高明霞3\"李鸿佳3\"张才擎3

摘要目的探讨布地奈德干预对哮喘小鼠核转录因子>B (NF-kB)、转化生长因子>1 (TGF-+1 )、相关炎症因子表达 及早期气道重塑的影响，进一步完善布地奈德治疗哮喘的理 论支持。方法随机将30只

小鼠BALF中IL-13、IL>、IL-5检测结果提示，布地奈德组分 与对

和

， 上述指

对

，

于哮喘组（！ <0. 05)。各组小鼠肺组织Weten blot结果显 示，布地奈德组NF>B p65、TGF>1含量明显高于对照组，哮 喘组则明显高于布地奈德组（！ <0. 05) ; Real-time PCR结果 显示NF-kB+65及

BALB/C雌性小鼠分为对照

组、布地奈德组和哮喘组，每组10只。布地奈德组、哮喘组

均采用鸡卵白蛋白（OVA)诱导建立哮喘模型，对照组则采

TGF-+的mRNA在哮喘组中的表达均

ELISA法测定小鼠肺泡灌洗液（BALF)中白介素-13 (IL-13 )、 白介素>(IL—)、白介素-5 ( IL-5 )的表达水平；Western blot 及Real-time PCR法分别定量分析肺组织中NF-kB +65、 TGF-+的蛋白表达及mRNA的表达;用医学图像采集系统 及医学图像分析软件测定支气管管腔的周长（PKm)、支气管 管壁面积（WAt)、支气管管壁平滑肌面积（WAm)及平滑肌 细胞计数（N)，将上述指标均用Pbm标准化。结果HE染

色表明哮喘组与对照组相比，哮喘组小鼠有显著的气道周围 炎症细胞浸润、黏膜下水肿、气管腔壁狭窄增厚等情况;各组

取生理盐水替代。HE染色观察小鼠肺组织炎症变化；

高于布地奈德组和对照组（！< 0. 05);图像软件分析显示，

布地奈德组Wat/Pbm、WAm/Pbm、N/Pbm较哮喘组有明显 改善，较对照组高，差异有统计学意义（！< 0. 05 )。结论 NF-kB/TGF>1信号通路可能是哮喘发病机制中的重要环 节，并可能参与哮喘早期气道重塑，布地奈德治疗哮喘的机 制之一可能通过抑制哮喘NF-kB、TGF>1的表达，从而改善

，干

+1;气道重塑

中图分类号R 3.5

。

关键词布地奈德；哮喘；核转录因子>

B;转化生长因子-

2018 -04 -28 接收

基金项目：山东省自然科学基金（编号:ZR2014HL003)作者单位:1泰山医学院研究生院，泰安

doi：10. 19405/j. cnki. issn1000 - 1492. 2018. 09. 004

271000

海2500

文献标志码A文章编号1000 -1492(2018)09 -1337 -06

2乳山市人民医院呼吸科，威

3山东大学附属千佛山医院呼吸内科，济

作者简介:邓鹏辉，男，硕士研究生；

南

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支气管哮喘是由遗传、环境等多种因素共同导

致的气道慢性炎症性疾病。随着人类生活环境的改 变，哮喘的发病率呈现出上升趋势，调查统计全球范 围内有近3亿哮喘患者，而目前在治疗中，激素干预 在哮喘治疗中的有效性成为国际共识[1]，其治疗哮

张才擎，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mal:

freezcq66@ 163. com

hCD137-PCDNA3.4 eukaryotic expression plasmid was constructed，followed by the expression，purification and i­

dentification using 293F cells and a CD137 transgenic cell line was obtained for screening hybridoma. Further- more，the experimental mice were immunized with CD137 protein to detect the serum titer of mice. Spleens of im­munized mice were fused with myeloma cells SP2/0 besides enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA) and flow cytometry were utilized to screen the hybridoma of mice. Simultaneously，the hybridoma ascites of mice were prepared and purified. Then，the total RNAof the mAb hybridoma cell line was extracted，reversely transcripted to cDNA，and the variable region sequence of mouse anti-human CD137 antibody was cloned. Subsequently theheavy chain and light chain expression vectors of humanized antil3dy were obtained accordingly，and HEK-293FTwas transfected instantaneously. The affinity of recombinant human antibody to antigen was detected and analyzedlater. The results displayed that the affinity of humanized antibodies of combined was not reduced，and6F5 had a competitive role with its ligand CD137L Corresponding protein binding epitop100. Conclusion We successfully prepares a humanized CD137 antibody，which lay the foundation for the nextstep in tumor treatment tn vivo.

Key words CD137 ;monoclonal antibody ;T cell activation

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