圈 ２０１３，ＶｏＩ．３０ Ｎｏ．７亿学与生物互程 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－－５４２５．２０１３．０７．０２３ 从发酵液中提取达托霉素的工艺优化 常 亮．魏增辉，李敏娜，梁冬，仲伟潭 （微生物药物国家工程研究中心河北省工业微生物代谢工程技术研究中心 华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北石家庄０５００１５） 摘要：通过对迭托霉素发酵液预处理、溶剂萃取、结晶、干燥得到达托霉素粗品。确定了以ｐＨ值６．５～７．５的缓 冲溶液作为浸提溶剂、加入５～８ ＢＶ丙酮进行冷藏结晶的优化提取工艺。该工艺简单、经济，适合工业化生产。 关键词：达托霉素；发酵液；萃取；结晶 ． 中图分类号：ＴＱ ４６５．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２—５４２５（２０１３）０７－－００８６—０２ 达托霉素是一种新型的环脂肽类抗菌素，具有独 一托利多仪器上海有限公司；ＬＣ－２０１０Ａ ＨＴ型高效 特的抗菌机制。达托霉素由连接到一个环状１３一氨基 液相色谱仪，Ｓｈｉｍａｄｚｕ；ＴＧＬ－１６Ｇ型高速离心机，上 酸肽的Ｎ－末端色氨酸上的癸酰基侧链构成，其中肽环 海安亭科学仪器厂。 或羧酸肽环是由氨基酸和非蛋白质源氨基酸通过酰胺 １．２方法 键或酯键构成的［１］。由于脂链和疏水性基团的存在， 用ｌ ｔｏｏｌ・Ｌ 盐酸调节达托霉素发酵液为酸性， 达托霉素具有一定的脂溶性，容易与细菌磷脂层反应， 离心分离后的澄清滤液几乎检测不到达托霉素，收集 因而具有良好的抗菌效果。 富含达托霉素的菌丝体；对菌丝体进行浸泡，加入正丁 达托霉素结构复杂，稳定性差，制备非常困难。国 醇萃取转相；收集正丁醇萃取溶液，加入丙酮，结晶、干 外采用微生物发酵法，通过离子交换树脂以及疏水介 燥，制得达托霉素粗品。 质提纯达托霉素瞳］，国内中科院上海有机化学研究所 对比不同溶剂、不同ｐＨ值缓冲溶液对菌丝体的 采用固相合成方法首次化学合成达托霉素［３］，福建微 浸提效果；同时对达托霉素的结晶条件进行研究，以优 生物研究所通过化学半合成工艺路线开发达托霉 化适合工业化的提取工艺路线。 素Ｌ４］。上述工艺路线复杂、周期长、成本高、产量低，距 离产业化仍有一段距离。文献［２ 报道，达托霉素在 ２结果与讨论 ｐＨ值较低情况下，可形成胶束状态。作者利用这一 ２．１溶剂对浸提效果的影响 ‘ 特性，采用微生物发酵法生产达托霉素，将达托霉素富 ２．１。１溶剂的选择 集到菌丝体，对从发酵液中提取达托霉素粗品的工艺 达托霉素偏酸性，在中性ｐＨ值下分子带负电荷， 条件进行了研究。 因而具有极好的水溶性。根据此特性，实验选择ｐＨ １ 实验 值７．０的缓冲溶液以及不同体积分数的乙醇、甲醇对 菌丝体进行浸泡。 １．１试剂与仪器 取达托霉素发酵液５ Ｌ，调节ｐＨ值为３．０，离心 达托霉素发酵液为华北制药集团新药研究开发有 分离得菌丝体。取菌丝体，均匀分为４份，以等体积的 限责任公司提供。 不同溶剂浸泡菌丝体３０ ｍｉｎ，离心分离收集上清液， 磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、珍珠岩、正丁醇均为 测定达托霉素浓度，计算浸提收率，结果见表１。 国产分析纯。 由表１可知，６Ｏ 乙醇以及４０ 甲醇对菌丝体的 双量程电子天平、ＦＥ２０型实验室ｐＨ计，梅特勒 浸提收率较高。考虑使用溶媒对环境的污染以及工业 收稿日期：２Ｏ１３一Ｏ４—１２ 作者简介：常亮（１９８０－），女，河北石家庄人，工程师，主要从事天然药物及微生物药物的分离纯化工作，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｌｓ１１９８０＠１６３．ｃｏｍ； 通讯作者：仲伟潭，高级工程师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｎｇｗｅｉｔａｎ＠１６３．ｃｏｍ。 常 亮等：从发酵液中提取达托霉素的工艺优化／２０１３年第７期 表１ 不同溶剂浸提菌丝体的效果对比 表３ 不同结晶条件下达托霉素粗品的质量和收率 Ｔａｂ．１ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｖｅｎｔｓ Ｔａｂ．３ Ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ ｃｒｕｄｅ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｒｙｓｔａＩＩｊｚａｔｉＯｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ 化生产成本问题，确定选用缓冲溶液作为溶剂。 ２．１．２不同ｐＨ值缓冲溶液对浸提效果的影响 取达托霉素发酵液３ Ｌ，调节ｐＨ值，离心分离菌 丝体，用不同ｐＨ值的等体积的缓冲溶液浸泡１ ｈ，离 心分离收集上清液，测定达托霉素浓度，计算一次浸提 ＊：ＨＰＬＣ纯度 收率；将上述离心分离所得菌丝体再浸泡１ ｈ，离心分 由表３可知，随着丙酮加入量的增加，结晶收率相 离，测定上清液中达托霉素浓度，计算二次浸提收率。 应提高，但丙酮加入量过多，会影响杂质的去除效果， 结果见表２。 粗品纯度有所下降。冷藏结晶较常温结晶对达托霉素 表２不同ｐＨ值缓冲溶液对菌丝体的浸提效果对比／％ 杂质有更好的去除作用。因此，确定适宜的达托霉素 Ｔａｂ．２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｆｏｒ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ 结晶条件为以５～８ ＢＶ丙酮冷藏结晶。 ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ｖａｌｕｅｓ／％ ３ 结论 确定了从发酵液中提取达托霉素的工艺条件为： 调节达托霉素发酵液为酸性，对分离的菌丝体采用 ｐＨ值６．５～７．５的缓冲溶液浸提，加入正丁醇进行萃 取使达托霉素转相，收集正丁醇萃取溶液加入５～８ 由表２可知，ｐＨ值６．５～７．５的缓冲溶液对达托 ＢＶ丙酮进行冷藏结晶，干燥后制得达托霉素粗品。 霉素浸提效果均较好。因此，确定适宜的缓冲溶液 该工艺路线简单、经济，适合工业化生产。 ｐＨ值为６．５－－－７．５。 参考文献： ２．２结晶条件的确定 ［１］史丽娟，石磊．新型抗革兰阳性菌药物——达托霉素［Ｊ］．中国医 在接近等电点时，达托霉素转入正丁醇相，同时可 药导刊，２００８，１０（７）：１１００１１１０１． 去除部分色素及杂蛋白。按照１．２方法制备达托霉素 ［２］Ｔ・Ｊ・凯莱赫，赖正吉，Ｊ・Ｐ・德库西，等．高纯度脂肽、脂肽胶束 及其制备方法［Ｐ］．ＣＮ １ ４０４ ４８７Ａ，２００３—０３—１９． 粗品，测定不同达托霉素的结晶条件（丙酮加量、结晶 ［３］徐红岩，陆婷婷．一种达托霉素的合成方法ＥＰ］．ＣＮ １０１ ２３５ 方式）下所制备的达托霉素粗品的质量和收率，结果见 ０８０Ａ，２００８－０８—０６． 表３。 ［４］郑卫，程元荣，周剑，等．一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法 ［Ｐ］．ＣＮ １０１ ８８０ ７０３Ａ，２０１０—１ Ｉ－１０． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ ｆｒｏｍ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｒｏｔｈ ＣＨＡＮＧ Ｌｉａｎｇ，ＷＥＩ Ｚｅｎｇ－ｈｕｉ，ＬＩ Ｍｉｎ－ｎａ，ＬＩＡＮＧ Ｄｏｎｇ，ＺＨＯＮＧ Ｗｅｉ—ｔａｎ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｂｅｉ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ ＮＣＰＣ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ ０５００１５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ ｃｒｕｄｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｃｒｙｓ— ｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｒｙ．Ｔｈｅ＇．ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ６．５～７．５ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｖｅｎｔ。ｔｈｅ ｃｏｌｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｏｎｅ ｗｉｔｈ ａｄｄｉｎｇ ５～８ ＢＶ ｏｆ ａｃｅ— ｔｏｎｅ．Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ，ｅｃｏｎｏｍｉｃ，ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｃｒｙｓｔａｌ１ｉｚａｔｉｏｎ
